常见细菌的鉴定办法

（一）实验原理

细菌对大分子的淀粉、蛋白质和脂肪不能直接利用，必须靠产生的胞外酶，如淀粉酶、蛋白酶和脂肪酶将大分子物质分解。胞外酶能分泌扩散到细胞外，将物质分解成小单位如糖、氨基酸、甘油与脂肪酸。这些小单位的物质能被细菌吸收和利用。水解过程可通过底物的变化来证明，如细菌水解淀粉的区域，用碘测定不再产生蓝色；水解明胶可观察到明胶被液化；脂肪水解后产生脂肪酸改变培养基的pH，其中的中性红指示剂使培养基从淡红色变为深红色。

（二）实验方法

将淀粉培养基溶化后，冷至45℃左右，以无菌操作制成平板。

取18-24h的纯培养物点于平板上，每皿可点种3-5个菌株，适温培养2-4d，形成菌落后，在平板上滴加卢戈氏碘液，以铺满菌落周围为度，平板成蓝色。如果菌落周围有无色透明圈出现，说明淀粉已经被水解，实验为阳性，否则为阴性。透明圈的大小一般说明水解淀粉的能力。

（三）实验试剂的配制

肉汤蛋白胨琼脂成分：蛋白胨10g，牛肉膏3g，氯化钠5g，琼脂17g，蒸馏水1000mL，pH7.2。

淀粉培养基制法：在肉汤蛋白胨琼脂中添加0.2％的可溶性淀粉，校正pH值至7.6，分装三角瓶，121℃ 20min灭菌备用。

卢戈氏(Lugol)碘液：碘片1g，碘化钾2g，蒸馏水300ml，先将碘化钾溶解在少量水中，再将碘片溶解在碘化钾溶液中，混匀，定容。

二糖发酵试验

(一)实验原理

单糖发酵是将葡萄糖，乳糖或麦芽糖等分别加入蛋白胨水培养基内，使其最终浓度为0.75-1％。并加入一定量酚红指示剂及小倒管，制成单糖发酵管，接种细菌经37℃培养18-24小时，若能分解糖产酸则酚红指示剂由红变黄，若能分解甲酸有CO2和H2等气体形成，小倒管内则聚集有气泡；不分解，则指示剂不变色。

(二)实验材料

1．菌种：大肠杆菌，伤寒杆菌18-24小时琼脂斜面培养物。

2．培养基：葡萄糖发酵管，乳糖发酵管等。

(三)实验方法

1．将伤寒杆菌，大肠杆菌按照液体接种方法分别接种于葡萄糖及乳糖发酵管内。

2．置37℃孵箱培养18-24小时。

3．观察结果：由于一些细菌能分解某种糖类产酸，所以培养基中pH下降到7.0以下，在酚红指示剂的显示下，培养基颜色由红变黄。产酸者以“+”表示，如果同时产生气体，则培养基中小倒管内有气泡出现，此乃产酸又产气，以“⊕”表示，不分解，则指示剂不变色，用“-”表示。

(四)实验结果

伤寒杆菌大肠杆菌

葡萄糖 + ⊕

乳 糖 - ⊕

(五)实验试剂的配制

1.单糖发酵管的制备： 成分：蛋白胨水培养基 100ml ，0.2%酚红 1ml ，所需糖（葡萄糖或乳糖）0.75-1g

制法：

（1）将上述成分溶化，混匀分装于内含有倒置小玻璃管的小试管中，每管约2ml，加塞。

（2）小倒管排气，灭菌（8-10磅，20-30分钟），贮存备用。

用途：供单糖发酵试验用。

2.0.2%酚红配制法

酚红（phenol red）0.2g ，0.lmol/LNaOH 8ml ，蒸馏水 92ml

将酚红入研钵徐徐加入0.lmol/LNaOH研磨，再补足蒸馏水即成。若需长时间保存，可高压灭菌后贮存备用。

三甲基红（M.R）试验

(一)实验原理

某些细菌如大肠杆菌等分解葡萄糖产生丙酮酸，继而分解为甲酸、乙酸、乳酸等，使培养基pH值降至4.5以下，加入甲基红指示剂呈红色，此为阳性反应；若产酸量少或产生的酸进一步转化为醇、醛、气体和水等，则培养基的酸碱度仍在pH 6.2以上，加入甲基红指示剂呈现黄色，为阴性反应。

(二)实验材料

1.菌种：大肠杆菌，产气杆菌18-24h琼脂斜面培养物。

2.培养基：葡萄糖蛋白胨水培养基。

3.试剂：甲基红试剂。

(三)实验方法

1.分别将大肠杆菌，产气杆菌接种于两支葡萄糖蛋白胨水培养基中。

2.置37℃培养2-3天取出，分别滴加甲基红试剂2-3滴，混匀，观察结果。

(四)实验结果

大肠杆菌：+，产气杆菌：-。

(五)实验试剂的配制

1．甲基红试剂的配制

甲基红 0.04g， 95%酒精 60ml ， 蒸馏水 40ml 。

先使甲基红溶解于酒精中，再加入蒸馏水，混合，摇匀即成。

2.葡萄糖蛋白胨水培养物

成分：蛋白胨5g 葡萄糖5g

制法：

（1）将上述成分溶解于蒸馏水中。

（2）调节pH至7.6，用滤纸过滤除渣。

（3）分装中试管，每管约3-4ml，灭菌后备用。

用途：供甲基红及V-P试验用。

四产吲哚（indole）试验

(一)实验原理

某些细菌如大肠杆菌，变形杆菌等具有色氨酸酶，能分解蛋白胨水培养基中的色氨酸，产生靛基质（无色吲哚），再与欧立希试剂（对二甲基氨基苯甲醛）反应，形成红色化合物—玫瑰吲哚，即为阳性反应。

(二)实验材料

1.菌种：大肠杆菌，伤寒杆菌18-24小时琼脂斜面培养物。

2.培养基：蛋白胨水培养基。

3.试剂，欧立希（Ehrlich）试剂（对二甲基氨基苯甲醛）

(三)实验方法

1.分别将大肠杆菌，伤寒杆菌接种于两支蛋白胨水培养基中。

2.置37℃培养2-3天后，每管沿管壁各加欧立希试剂0.5-1ml于培养液面上，待1-2分钟后观察结果：在交界面出现玫瑰红色环即为吲哚试验阳性，无红色环即为阴性。

(四)实验结果

大肠杆菌：+ ；伤寒杆菌：- 。

(五)实验试剂的配制

1.蛋白胨水培养基的制备

成分：蛋白胨10g 氯化钠5g 蒸馏水1000ml

制法：

（1）先用少量蒸馏水将蛋白胨和氯化钠相混合溶解,再加足蒸馏水量。

（2）调节pH至7.6、用滤纸过滤。

（3）分装中试管，每管约3-4ml，加塞灭菌后备用。

2.欧立希（Ehrlich）试剂的配制

对位二甲基氨基苯甲醛 4g

95%酒精 380ml

浓硫酸或浓盐酸80ml

三种成分混合即成，瓶口要严密，以免挥发。

五硝酸盐还原试验

(一)硝酸盐还原试验原理：

硝酸盐还原反应包括两个过程：一是在合成过程中，硝酸盐还原为亚硝酸盐和氨，再由氨转化为氨基酸和细胞内其他含氮化合物；二是在分解代谢过程中，硝酸盐或亚硝酸盐代替氧作为呼吸酶系统中的终末受氢体。能使硝酸盐还原的细菌从硝酸盐中获得氧而形成亚硝酸盐和其他还原性产物。但硝酸盐还原的过程因细菌不同而异，有的细菌仅使硝酸盐还原为亚硝酸盐，如大肠埃希菌；有的细菌则可使其还原为亚硝酸盐和离子态的铵；有的细菌能使硝酸盐或亚硝酸盐还原为氮，如假单胞菌等。硝酸盐还原试验系测定还原过程中所产生的亚硝酸盐。

(二)培养基：

硝酸盐培养基。

(三)试剂：

甲液（对氨基苯磺酸0.8g+5mol/L醋酸100ml）；乙液（α-奈胺0.5g + 5mol/L醋酸100ml）。

(四)方法：

被检菌接种于硝酸盐培养基中，于35℃培养1～4d。将甲、乙液等量混合后（约0.1ml）加入培养基内，立即观察结果。

(五)结果：

出现红色为阳性。若加入试剂后无颜色反应，可能是：①硝酸盐没有被还原，试验阴性；②硝酸盐被还原为氨和氮等其他产物而导致假阴性结果，这时应在试管内加入少许锌粉，如出现红色则表明试验确实为阴性。若仍不产生红色，表示试验为假阴性。

若要检查是否有氮气产生，可在培养基管内加一小倒管，如有气泡产生，表示有氮气生成。

(六)应用：

本试验在细菌鉴定中广泛应用。肠杆菌科细菌均能还原硝酸盐为亚硝酸盐；铜绿假单胞菌、嗜麦芽窄食单胞菌等假单胞菌可产生氮气；有些厌氧菌如韦荣球菌等试验也为阳性。

(七)实验试剂的配制

硝酸盐液体培养基

蛋白胨5.0g，KNO3 0.2g, 蒸馏水1000 mL，pH7.4，每管分装4-5mL，121℃灭菌15-20min。

六产氨实验（尿素分解实验）

(一)实验原理

某些细菌如变形杆菌，具有尿素分解酶，能分解尿素而产生氨，氨溶于水变成氢氧化铵，使培养基变碱而呈红色即为阳性。

(二)实验材料

1.菌种：变形杆菌，伤寒杆菌18-24小时琼脂斜面培养物。

2.培养基：尿素培养基。

(三)实验方法

1.分别以斜面接种法将变形杆菌，伤寒杆菌接种于两支尿素斜面培养基上。

2.置37℃培养18-24小时。

3.取出观察结果，培养基变为红色，即尿素分解试验阳性，若不变色，即为尿素分解试验阴性。

(四)实验结果

变形杆菌：+ ；伤寒杆菌：- 。

(五)实验试剂的配制

1.尿素培养基的制备

成分： 蛋白胨1g 、氯化钠5g、葡萄糖1g、蒸馏水900ml、琼脂15-20g 、0.1%酚红 12ml 、20%尿素水溶液（无菌）100ml 。

制法：（1）除尿素、琼脂和酚红外，其余成分溶于水中，加热溶化，矫正pH至6.8-6.9。

（2）加入琼脂和酚红，115℃磅灭菌10min。

（3）冷却至60℃后加入无菌尿素溶液，摇匀。

（4）分装中试管（无菌），每管3-4ml，置成斜面备用。

说明：（1）尿素不耐热，也不能久存，只能用滤器除菌。

2.无菌尿素溶液制备：称取尿素20g，混合于100ml蒸馏水中，充分摇匀，用G6滤菌器过滤除菌，以达到无菌的目的。

七柠檬酸盐利用试验

(一)实验原理

本试验用于检测细菌利用柠檬酸的能力。细菌利用柠檬酸盐的能力不同，如各种肠细菌可利用柠檬酸为碳源，而大肠埃希氏菌则不利用柠檬酸盐。因此，能否利用柠檬酸盐是一项鉴别性特征。培养基中含有柠檬酸钠时，如将柠檬酸分解为CO2，则培养基中由于有游离钠离子呈碱性，使培养基中酚红指示剂（pH6.8-8.4，黄→红）由淡粉红色变为玫瑰红色以识别之。

(二)材料

柠檬酸钠2g、K2HPO4 1g、NH3H2PO4 1g、NaCl 5g、MgSO4 0.2g、琼脂 1.5 2g、1%溴麝香草酚蓝(酒精溶液)或0.04%苯酚红 10ml、水 1000ml

将上述各成分加热溶解后，调PH6.8，然后加入酚红指示剂，摇匀，用脱脂棉过滤。制成后为黄绿色，分装试管。121℃灭菌20min后制成斜面。

(三)实验内容

1.将试验菌在斜面上划线接种，适温培养3-5天。

2.若该菌能利用柠檬酸盐，则可在此斜面上生长并将培养基由原来的淡粉红色变为玫瑰红色，此为阳性；颜色不变者为阴性。

八油脂水解试验

(一)原理

某些细菌能够分泌脂肪酶（胞外酶），能将培养基中的脂肪水解为甘油和脂肪酸。所产生的脂肪酸，可通过预先加入油脂培养基中的中性红加以指示[指示范围pH6.8（红）～pH8.0（黄）]。当细菌分解脂肪产生脂肪酸时，培养基中出现红色斑点。

(二)实验内容

1.将装有油脂培养基的锥形瓶置于沸水浴中融化，取出并充分振荡（使油脂均匀分布），再倾入培养皿中，待凝固后制成平板。

2.翻转平板使底皿背面向上，用记号笔在其背面玻璃上划成两半。一半用于接种金黄色葡萄球菌作为阳性对照菌，另一半用于接种实验菌大肠杆菌或产气肠杆菌。接种时用接种环取少量菌在平板两边各划线接种。

3.将接种完的平板倒置于37℃恒温箱中，培养24h。

4.观察结果时，注意观察平板上长菌的地方，如出现红色斑点，即说明脂肪已被水解，此为阳性反应。

（三）培养基配制

油脂培养基：蛋白胨10g，牛肉膏5g，氯化钠5g，香油或花生油10g，中性红（1.6%水溶液）约0.1ml，琼脂15-20g，蒸馏水1000mL，pH7.2，121℃灭菌20min。

九接触酶试验

(一)实验原理

本试验用于检测细菌是否具有接触酶活性。接触酶又称为过氧化氢酶，是一种以正铁血红素作为辅基的酶，能将过氧化氢分解为水和氧。一般好氧细菌与兼性厌氧细菌（除某些链球菌、乳酸杆菌等外）都能产生接触酶，而厌氧细菌不产生接触酶，这是用以区别好氧和厌氧菌的方法之一。

(二)材料

牛肉膏、蛋白胨琼脂培养基，3%过氧化氢。

牛肉膏、蛋白胨琼脂培养基：牛肉膏 0.3g、蛋白胨 1g、氯化钠 0.5g、琼脂 2g、自来水 100mL、pH 7.0～7.2 、灭菌。

(三)实验内容

1.接种试验菌，适温下培养18-24小时。

2.将3%的过氧化氢滴于斜面菌苔上（或涂有菌苔的载玻片上），静置1-3分钟后，如有气泡产生即为阳性。不产生气泡者为阴性。

(四)应用

革兰阳性球菌中，葡萄球菌和微球菌均产生过氧化氢酶，而链球菌属为阴性，故此试验常用于革兰阳性球菌的初步分群。

十革兰氏染色

(一)实验原理

革兰氏染色法是细菌学中广泛使用的一种鉴别染色法。通过结晶紫初染和碘液媒染后，在细胞壁内形成了不溶于水的结晶紫与碘的复合物，革兰氏阳性菌由于其细胞壁较厚、肽聚糖网层次较多且交联致密，故遇乙醇或丙酮脱色处理时，因失水反而使网孔缩小，再加上它不含类脂，故乙醇处理不会出现缝隙，，因此能把结晶紫与碘复合物牢牢留在壁内，使其仍呈紫色；而革兰氏阴性菌因其细胞壁薄、外膜层类脂含量高、肽聚糖层薄且交联度差，在遇脱色剂后，以类脂为主的外膜迅速溶解，薄而松散的肽聚糖网不能阻挡结晶紫与碘复合物的溶出，因此通过乙醇脱色后仍呈无色，再经沙黄等红色染料复染，就使革兰氏阴性菌呈红色。

(二)实验方法

革兰氏染色法一般包括初染、媒染、脱色、复染等四个步骤，具体操作方法是：

1.涂片固定。

2.草酸铵结晶紫染1分钟。

3.自来水冲洗。

4.加碘液覆盖涂面染约1分钟。

5.水洗，用吸水纸吸去水分。

6.加95%酒精数滴，并轻轻摇动进行脱色，20秒后水洗，吸去水分。

7.蕃红梁色液（稀）染2分钟后，自来水冲洗。干燥，镜检。

[染色的结果]：革兰氏正反应菌体都呈紫色，负反应菌体都呈红色。

(三)应用

其重要的临床意义在于：1.鉴别细菌 2.选择药物 3.与致病性有关：：革兰氏阳性菌能产生外毒素，革兰氏阴性菌能产生内毒素，两者的致病作用不同。