方法名称： 叶酸片－叶酸－高效液相色谱法

应用范围： 本方法采用高效液相色谱法测定叶酸片中叶酸的含量。

本方法适用于叶酸片。

方法原理： 供试品研细，经氨溶液溶解后，用水定量稀释，进入高效液相色谱仪进行色谱分离，用紫外吸收检测器，于波长254nm处检测叶酸的峰面积，计算出其含量。

试剂： 1 .甲醇

2. 磷酸二氢钾

3. 0.1mol/L氢氧化钾溶液

4. 0.5%氨溶液

仪器设备： 1. 仪器

1.1 高效液相色谱仪

1.2 色谱柱

十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂。

1.3 紫外吸收检测器

2. 色谱条件

2.1 流动相：以磷酸二氢钾6.8g与0.1mol/L氢氧化钾溶液70mL，加水稀释至850mL，并调节pH值至6.3±0.1，加甲醇80mL，用水稀释成1000mL的溶液

2.2 检测波长：254nm

2.3 柱温：室温

试样制备： 1. 对照品溶液的制备

精密称取叶酸对照品约5mg，置25mL量瓶中，加0.5%氨溶液约15mL溶解后，用水稀释至刻度，摇匀，即为对照品溶液。

2. 供试品溶液的制备

取本品50片（0.4mg规格）或20片（5mg规格），精密称定，研细，精密称取适量（约相当于叶酸5mg），置25mL量瓶中，加0.5%氨溶液约15mL，置热水浴中加热20分钟，时时振摇使叶酸溶解，放冷，用水稀释至刻度，摇匀，滤过，续滤液即为供试品溶液。

注：“精密称取”系指称取重量应准确至所称取重量的千分之一。“精密量取”系指量取体积的准确度应符合国家标准中对该体积移液管的精度要求。

操作步骤： 分别精密吸取对照品溶液和供试品溶液各20mL，注入高效液相色谱仪，用紫外吸收检测器于波长254nm处测定叶酸（C19H19N7O6）的峰面积，计算出其含量。

参考文献： 中华人民共和国药典，国家药典委员会编，化学工业出版社，2005版，一部，p.109。