1.色谱条件与系统适应性试验

色谱柱：岛津VP-ODS c柱（250mm×4.6 mm，5μm）；流动相：乙腈（A）一0.2%磷酸溶液（B）（A+B=100%）作梯度洗脱， t=0—6 min，A：27%；t=6—10 min，A：30%；t=10—15 min. A：60%；15—25 min，A：90%；流速：1.O mL/min；检测波长：278 nm；柱温：25℃；进样量20μl.在上述色谱条件下，4种待测组分与邻近组分达到了基线分离，理论塔板数按绿原酸峰计算不低于3 000.

2.溶液的制备

2.1对照品溶液的制备精密称取绿原酸、黄芩苷、连翘苷和汉黄芩素对照品适量，置10 mL容量瓶中，加50%甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，分别制成浓度为1.10、1.03、0.51、0.44 mg/mL的对照品母液。

2.2供试品溶液的制备精密吸取双黄连口服液1.0 mL，置50 mL容量瓶中，加50%甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，0.45 um微孔滤膜过滤，即得。

2.3 阴性对照溶液的制备按处方比例及制备工艺，分别制备缺金银花、黄芩、连翘的阴性对照样品，按供试品溶液的制备方法制成阴性对照品溶液。

3.线性关系考察

分别精密吸取绿原酸对照品母液0.20、o.40、0.75、1.50、3.O mL，黄芩苷对照品母液0.25、0.50、1.O、2.0、3.0mL，连翘苷对照品母液0.20、0.40、0.60、1.20、2.0汉黄芩素对照品母液0.15、o.25、0.50、1.0、2.0 IfIL，对应加入10 IIlL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，配制成5个浓度的混合对照品溶液，进样测定，记录色谱图。以峰面积为纵度标，分别以绿原酸、黄芩苷、连翘苷和汉黄芩素进样量为横坐标，绘制标准曲线，得回归方程。绿原酸：Y=1.04×loX+1.40×10，R=0.999 6；黄芩苷：y=3.87×106X——I.26*104，，=0.999 9；连翘苷：Y=6.44×lOSX+1.74×10 ，R=0.9999；汉黄芩素：Y=6.30×IO~X+1.45×lOs，r=O.9999结果表明，绿原酸进样量在0.44～6.60 μg范围内，黄芩苷进样量在0.52～6.18μg范围内，连翘苷进样量在o.20～2.04μg范围内，汉黄芩素进样量在o.13～1.76 μg范围内，线性关系良好。

精密吸取绿原酸、黄芩苷、连翘苷和汉黄芩素混合对照品溶液注入液相色谱仪，连续进样5次，绿原酸峰面积RSD：1.12%，黄芩苷峰面积RSD=O.86%，连翘苷峰面积RSD=O.72%汉黄芩素峰面积RSD=0.58%。结果表明，所选方法精密度良好。

4.稳定性试验

精密吸取同一供试品溶液，分别在O、2、4、6、8、10、12、24 h进样，测定样品中绿原酸、黄芩苷、连翘苷和汉黄芩素的峰面积，结果绿原酸RSD=l_74%，黄芩苷RSD=2.04%，连翘苷RSD=1.81%，汉黄芩素RSD=2.38%，表明样品溶液在24 h内稳定。

5.重复性试验

精密称取同一批号5份样品，按供试品溶液制备方法制备，进样，记录峰面积，结果绿原酸RSD=1.48%，黄芩苷RSD=1.53%，连翘苷RSD=1.34%，汉黄芩素RSD=1.58%，表明方法重复性良好。

6.阴性对照试验

分别取对照品溶液、供试品溶液和阴性对照溶液，按“2.1”项下色谱条件进样测定，绘制色谱图。结果阴性对照潮液在供试品溶液及对照品溶液中绿原酸、黄芩苷、连翘苷和汉黄芩素保留时间相应位置上均无吸收峰出现，表明阴性对照无干扰。

7.加样回收率试验

精密量取同一批号0.2 mL双黄连口服液4份于50 mL祠量瓶中，分别加入绿原酸、黄芩苷、连翘苷和汉黄芩素对照品溶液适量，加50%甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，0.45μ微孔滤膜过滤。按“2.1”项下色谱条件进样测定其含量，计算加样回收率。