固定信号法测定原理是随着反应进行，通过不断添加试剂使吸光度变化在很窄范围内，此时所测的是加试剂的量，并依此来计算物质浓度。最典型例子是以对硝基酚作为指示剂的乙酰胆碱酯酶方法，在反应过程中不断加入碱以中和酶水解产物乙酸以维持pH不变，然后根据所加碱量计算酶含量。这一类方法由于操作费时麻烦，目前应用很少，医|学教育网搜集整理但不应忘记这类方法能维持反应条件如pH的恒定性，其它如在NADH参与的反应中不断加入NADH有助于避免底物的消耗，在一些特殊情况下可能还是有用的。