本章重点:

　　掌握：DNA克隆概念，限制性内切酶的定义及其特点，基因载体的种类。重组DNA技术的基本过程，目的基因获取的方法，外源基因与载体的连接方式，重组DNA分子导入受体菌的方式，重组体筛选的方法。

　　熟悉：基因组DNA文库和cDNA文库的概念，目的基因表达体系的种类及其特点

　　了解：自然界基因转移的方式：接合作用、转化及转导作用、转座；重组有两种类型，即位点特异性的重组和同源重组

　　本章难点

　　两种类型基因重组的机理；限制性内切酶的作用特点，基因载体的种类；重组DNA技术的基本环节中，目的基因的获取方法，外源基因与载体连接的方法，重组DNA导入受体菌的方法，重组体的筛选方法，以及原核和真核表达体系的优缺点比较

　　基本要点

　　一、自然界的基因转移和重组

　　自然界不同物种或个体之间的基因转移和重组是经常发生的，它是基因变异和物种进化的基础。自然界的基因转移的方式有：

　　接合作用：当细胞与细胞、或细菌通过菌毛相互接触时，质粒DNA 就可从一个细胞(细菌)转移至另一细胞(细菌)，这种类型的DNA转移称为接合作用(conjugation )。

　　转化作用(transformation) 通过自动获取或人为地供给外源DNA，使细胞或培养的受体细胞获得新的遗传表型。

　　转导作用：当病毒从被感染的(供体)细胞释放出来、再次感染另一(受体)细胞时，发生在供体细胞与受体细胞之间的DNA转移及基因重组即为转导作用(transduction)。

　　转座：大多数基因在基因组内的位置是固定的，但有些基因可以从一个位置移动到另一位置。这些可移动的DNA 序列包括插入序列和转座子。由插人序列和转座子介导的基因移位或重排称为转座(transposition )。

　　基因重组：在接合、转化、转导或转座过程中，不同DNA分子间发生的共价连接称基因重组。基因重组包括位点特异性的重组和同源重组两种类型。有整合酶催化的在两个DNA序列特异位点间发生的整合，产生位点特异的重组。特异重组依赖特异的DNA序列，如λ噬菌体的整和酶可识别噬菌体DNA和宿主染色体的特异靶位点，并进行选择性整合；反转录病毒整合酶识别整合反转录病毒cDNA的长末端重复序列等。另外有发生在同源序列间的同源重组，又称基本重组。同源重组依赖两分子间序列的相同或相似性，将外源DNA整合进宿主染色体。

　　二、重组DNA技术相关概念

　　1．DNA克隆(DNA cloning) 就是应用酶学的方法，在体外把目的基因与载体DNA结合成具有自我复制能力的DNA分子一一复制子(replicon)，继而通过转化或转染宿主细胞、筛选出含有目的基因的转化子细胞，再进行扩增、提取获得大量同一DNA分子，即DNA克隆。由于早期研究是从较大的染色体分离、扩增特异性基因，因此DNA克隆又称基因克隆(gene cloning )。

　　2．工具酶 在重组DNA技术即基因工程技术中需应用某些基本酶类进行基因操作，称为工具酶。常用的工具酶包括如DNA聚合酶Ⅰ、DNA连接酶、末端转移酶、反转录酶、多聚核苷酸激酶，而限制性核酸内切酶特别重要，应用最广。

　　限制性内切核酸酶(restriction endonuclease) 是能够识别DNA的特异序列，并在识别位点或其周围切割双链DNA的一类内切酶。限制性内切核酸酶存在于细菌体内，与相伴存在的甲基化酶共同构成细菌的限制－修饰体系，限制外源DNA、保护自身DNA，对细菌遗传性状的稳定遗传具有重要意义。目前发现的限制性内切核酸酶有1800种以上。限制性内切核酸酶分为三类。重组DNA技术中常用的限制性内切核酸酶为Ⅱ类酶，例如，EcoRI、BamH I等就属于这类酶。大部分Ⅱ类酶识别DNA位点的核苷酸序列呈二元旋转对称，通常称这种特殊的结构顺序为回文结构(Palindrome)。所有限制性内切核酸酶切割DNA均产生含5'磷酸基和3'羟基基团的末端。限制性内切核酸酶的特点：①识别DNA的特异序列并切割；②不同的酶识别核苷酸序列往往包含4个到6个核苷酸；③不同的酶切割DNA频率不同；④可产生粘性或钝性未端；带有相同类型的粘性末端或钝性末端的DNA都可以再相互连接。

　　3．目的基因 基因工程中常为分离、获得某一感兴趣的基因或DNA序列，或为得到感兴趣的基因的蛋白质表达产物，这种感兴趣的基因或DNA序列称为目的基因。目的基因可来自cDNA和基因组DNA，cDNA(complementary DNA )是指以mRNA或病毒RNA经反转录酶催化合成互补单链DNA，再聚合生成的双链cDNA；基因组DNA(genomic DNA)则指代表一个细胞或生物体全套遗传信息的所有DNA 序列。

　　4．基因载体 基因载体也称克隆载体，是指用以携带外源目的基因，实现外源DNA克隆及表达为有意义蛋白质而利用的DNA分子。能使插入的外源DNA序列可被转录并翻译成多肽链而专门设计的基因载体又称表达载体。常用基因载体包括质粒、噬菌体、病毒DNA等。理想载体有独立复制能力，能够利用宿主酶系转录和翻译，有多种限制性内切酶单一切口及一定筛选标记，如质粒的抗药性基因

　　（1）质粒(plasmid) 存在于细菌染色体外的小型环状双链DNA分子。能在宿主细胞独立自主地进行复制，会赋予宿主细胞一些遗传性状，如对抗生素或重金属的抗性等。质粒赋予细菌的表型可识别质粒的存在，是筛选转化子细菌的根据。

　　（2）噬菌体DNA 常用作基因载体的噬菌体DNA有λ噬菌体、M13噬菌体，经M13噬菌体改造的载体含不同位置的克隆位点，可接受不同限制性内切酶切片段。

　　（3）另外还有可插入大片段外源基因的柯斯质粒载体、酵母人工染色体载体，用于真核基因表达的腺病毒载体和逆转录病毒载体等。

　　三、重组DNA技术基本原理

　　DNA克隆过程包括:目的基因的获取，基因载体的选择与构建，目的基因与载体的拼接，重组DNA分子导人受体细胞，筛选并无性繁殖含重组分子的受体细胞(转化子)。

　　目的基因的获取常用的方法：化学合成法、基因组DNA文库、cDNA文库 聚合酶链反应

　　克隆载体的选择和构建：将外源DNA连到复制子上，外源DNA则可作为复制子的一部分在受体细胞中复制。这种复制子就是克隆载体。

　　外源基因与载体的连接：粘性末端连接包括同一限制酶切割位点连接和不同限制性内切酶位点连接；平端连接；同聚物加尾连接；人工接头连接。

　　重组DNA导入受体菌：导入重组DNA分子的方法有转化(transformation)、转染(transfectim)和感染(infection)等。受体细胞为细菌时，常采用电穿击法、热击法等。

　　重组体的筛选：根据载体体系、宿主细胞特性及外源基因在受体细胞表达情况不同，可采取直接选择法和非直接选择法。直接选择法，指对载体携带某种或某些标志基因和目的基因而设计的筛选方法，其特点是直接测定基因或基因表型；抗药性标志选择，标志补救，分子杂交法； 免疫学方法不是直接鉴定基因，而是利用特异抗体与目的基因表达产物相互作用进行筛选，因此属非直接选择法。免疫学方法特异性强、灵敏度高，尤其适用于选择不为宿主菌提供任何选择标志的基因。免疫学方法又可根据具体基因选择操作过程不同，分为免疫化学方法及酶免检测分析等。

　　克隆基因的表达：目的基因的表达体系的建立包括表达载体的构建、受体细胞的建立及表达产物的分离、纯化等技术和策略。表达体系包括原核表达体系和真核表达体系两类。E. coli是当前采用最多的原核表达体系，其优点是培养方法单、迅速、经济而又适合大规模生产工艺，人们运用E.coli表达外源基因已有20多年的经验。在实际工作中，根据表达的基因不同，选择不同的表达策略。E.coli表达体系在实际应用中尚有一些不足之处：①由于缺乏转录后加工机制；②由于缺乏适当的翻译后加工机制；③表达的蛋白质常常形成不溶性的包涵体，欲使其具有活性尚需进行复杂的复性处理；④很难在Ecol表达体系表达大量的可溶性蛋白。真核表达体系如酵母、昆虫及哺乳类动物细胞表达体系显示了较大优越性。尤其是哺乳类动物细胞，不仅可表达克隆的cDNA，而且还可表达真核基因组DNA；哺乳类细胞表达的蛋白质通常总是被适当修饰，而且表达的蛋白质会恰当地分布在细胞内一定区域并积累。哺乳类动物细胞表达体系的缺点是操作技术难、费时、不经济。常用于细胞转染的方法有：磷酸钙转染、DEAE葡聚糖介导转染、电穿孔、脂质体转染及显微注射等。当前采用最多的哺乳类细胞是COS细胞(猿个猴肾细胞)和CHO细胞(中国仓鼠卵巢细胞)。

　　四、重组DNA技术与医学的关系

　　1990年，分子医学(molecular medicine )的诞生及其在近几年的发展正是重组DNA技术与医学实践相结合的结果。分子医学包含的领域及内容概括如下几个方面。

　　1．疾病基因的发现 重组DNA技术的应用使分子遗传学家有可能根据基因定位，而不是它的功能来克隆一个基因。根据克隆基因的定位和性质研究所提供的线索，可进一步确定克隆的基因在分子遗传病中的作用。因此，一个疾病相关基因的发现不仅可导致新的遗传病的发制图或定位，并掌握其全部序列信息，人类则完全可能通过对候选基因的控制和改造，从根本上治疗和防止遗传病的发生和流行。

　　2．发展生物制药 利用重组DNA技术生产有药用价值的蛋白质、多肽产品已成为当今世界一项重大产业。重组蛋白质药物生产是在功能研究、基因克隆基础上，构建适当的表达体系表达有生物活性的蛋白质、多肽；再经过科学的动物实验、严格的临床试验和药物审查，发展为新药物。

　　3．遗传病的预防 受累疾病基因克隆不仅为医学家提供了重要工具，使他们能深入地认识、理解一种遗传病的发生机制，为寻求可能的治疗途径、预测疗效提供了有力手段；更重要的是，利用这些成果进行极有意义的产前诊断和症候前诊断，而后通过诊断技巧与治疗、预防能力的结合，从根本上杜绝遗传性疾病的发生和流行。预防方法包括：产前诊断、携带者测试、症候前诊断、遗传病易感性分析。