登革热诊断标准及处理原则附录B：登革热病原学检测

B1应用单克隆抗体免疫荧光法（mbAb-IFA）检测DV抗原

B1.1原理

感染DV的蚊虫体内，携带有DV抗原，可用DV单克隆抗体免疫荧光法检出蚁体内的特异性抗原。

B1.2材料

多孔载玻片、10～l00 μL可调加样器、染色钵、试管、pH7.2PBS Dl～D4型单克隆抗体、羊抗鼠IgG、丙酮等。

B1.3检测步骤（问接法）

B1.3.1 蚊虫标本制备：待蚊虫胃内容物消化后，置-40℃冻死，用解剖刀去翅，肢，将头部和躯体分别放于载玻片圈内，盖上一块与之相对应的玻片，轻轻加压，使蚊组织最大限度地附在玻片上，小心分开两玻片，用镊子去除大片的骨骼，吹干，冷丙酮固定10 min.

B1.3.2用PBS轻轻洗一次，再用蒸馏水洗一次，吹干。

B1.3.3加DF单克隆抗体，覆盏蚊组织，置于湿盒中，37℃水浴30 min.

B1.3.4取出，用PBS洗2次，蒸馏水洗1次，吹干。

B1.3.5加羊抗鼠lgG，如B1.3.3、B1.3.4，孵育，洗涤。

B1.3.6封片胶封片，荧光镜检。如单抗已荧光标记则免去BI. 3.5，即为直接法。

B1.4结果判断

用荧光显微镜观察，检出组织细胞质内有特异性黄绿色荧光，判为阳性医|学教育网整理，阴性无荧光出现。

B1.5 意义

在蚊虫组织中，检出DV抗原。可确诊被检蚊虫携带有DV，可用于登革热流行病学调查。

B2 C6/36白纹伊蚊细胞分离DV

B2.1原理

DV是一种具有严格的细胞内存活的生物，必须生活在活的细胞组织内。C6/36白纹伊蚊细胞对DV十分敏感，藉观察病毒对其产生的变化（病变等现象）和应用特异、敏感的检测技术，检出病毒的存在和型别。

B2.2材料

C6/36白纹伊蚊细胞、新生小牛血清、日本Eagles、青霉索、链霉素、各型DV单克隆抗休、羊抗鼠荧光IgG及免疫荧光试验用品。

B2.3检材的采集及处理

B2.3.1病人：无菌采集发病后5d内静脉血3 mL.放冰壶送实验室分离血清接种组织培养，不能及时接种的可放-20℃保存。对污染的血渍要先加青霉索、链霉素（最终浓度各为500 kU/L）。4℃作用2h处理后按种。接种后余下的血消为早期血清，供血济学试验用。

B2. 3.2尸体检材：可取血，脑行液、脑组织、肝等。

B2.3.3蚊：采集吸过血的埃及伊蚊。白纹伊蚊或其他可疑蚊种，用0.50 mol/L（10%）葡萄搪液喂养，至胃血完全消化后置-20℃，待死后按蚊种及捕获地点分组，以5～10只一组为宜，经生理盐水冲洗数次后，用研磨器研碎，每组加0.5 mL Hank's液，2 000 r/min离心15 min，取上清液加青霉素、链霉素【最终浓度1 MU/L（1 000 U/mL）】4℃过夜，备用。

B2.4病毒分离

C6136（白纹伊蚊纯系细胞株）传代细胞。待细胞长成单层后，倒去培养液，每管接种月Hank's液稀释成10-1的患者血清0.1mL或蚊悬液或组织悬液0.2 mL，37℃吸附l h后加维持液0.9 mL及0.8mL，置35 ℃静止培养，观察7天，若细胞出现膨大至融合，折光度增强、颗粒增多等现象，取细胞悬液0.1 mL，进行传代，仍出现同样病变者应保种并进行鉴定，若7天后细胞不出现病变，需盲传l～2代，仍不出现病变者用问接免疫荧光试验作进一步检查，阴性者作阴性报告。

B2.5间接免疫荧光试验（FA/IFA）鉴定DV

B2.5.1 试验方法

B2.5.1.1 细胞片的制备：把出现“++”病变的C6/36细胞管倒去维持液，（若不出现病变医|学教育网整理，则需培养7天再制片）用pH7. 2PBS洗2次后加PBS 3 mL，用滴管把细胞从管壁上吹下，吹散，2 000 r/min离心5 min，弃去PBS.加O～2 mLPBS把沉淤吹散，滴加在10孔的载玻片符孔中，电风扇吹干，加冷丙酮固定10 min，用PBS冲洗2次，蒸馏水漂洗1次，吹干，-20℃保存。正常C6/36细胞对照按同法制片。

B2.5. 1.2试验方法：取出保存的待鉴定细胞片或腑组织片，吹干，于各孔中按顺序滴加4个型DV使用单位的单克隆抗体，备型2孔，对照2孔滴加PBS，置湿盒内37℃水浴30 min.取出用PBS冲洗3次，蒸馏水深洗1次，吹干，滴加含130 μmol/L（1 ：8 000）伊文思兰的2单位抗鼠IgG荧光抗体，置湿众内37℃水浴30 min，用PBS冲洗3次，蒸馏水漂洗1次，吹干，用甘油缓冲液封片，镜检，记录结果。

B2.5.2结果判断

特异性免疫荧光呈黄绿色颗粒，分布在感染细胞的胞浆内，正常组织细胞被染成橙红色或暗红。

B2.5.3意义

从病人血液、组织或蚊媒中分离出DV，经鉴定，可确诊DV感染和病毒型别。

B3应用乳小白鼠分离DV

B3.1原理

新生小白鼠对DV十分敏感，藉观察病毒对其产生的致病等现象和应用特异、敏感的检测技术，检出病毒的存在和型别。

B3.2材料

同B2.2.C6/36白纹伊蚊细胞改用1～3日龄乳小白鼠。

B3.3检材采集及处理

参考B2.3.

B3.4病毒分离

每一检材接种一窝l～3日龄小白鼠，每只脑内接种全血或1：10血清或蚊悬液、组织悬液10～20μL，接种后48 h内死亡者作非特异性死亡，弃去。存活者观察至10 d左右仍未发病时，剖取其中2只， 取脑，用pH8.0肉汤制成10%悬液，盲传1～3口龄小白鼠一窝，其余的及盲传的均观察至第四周。未发病作阴性结果：在观察期内若发病（松毛、蜷缩、活动力降低、站立不稳、抽搐、离群、不进食、瘫痪等症状）则削取半边脑，按盲传法制成10%鼠脑悬液，转种1～3日龄小白鼠，并作无菌试验。另一半脑置5.43 mol/L（50%）甘油缓冲液中低温保存。无菌试验阴性而重复以上症状的乳鼠作为可疑毒株传代、保种，并进行鉴定。

B3.5病毒鉴定

B3.5.1 问接免疫荧光试验（FA/IFA）

B3.5.1.1 脑组织片的制备；取发病濒死的小鼠脑组织以冰冻切片制成10孔组织片，经吹干，冷丙酮固定10 min，冲洗、吹干后放-20℃保存。正常脑组织同法制作。

P.3.5.1.2试验方法、结果和意义，同B2.5.

B3.5.2血凝抑制试验

原理、材料与方法参考人2.

意义：鉴定病毒和病毒分型。

a3.5.3补体结合试验

原理、材料与方法、意义参考A3.

s3.5.4中和试验

原理、材料与方法、意义参考A6.

B4 RT-PCR技术检测DF病毒基因及基因分型

B4.1原理

PCR技术（聚合酶链反应）是利用双链脱氧核糖核酸（DNA）分子碱基配对原则，在一定条件下扩增DNA片段的体外扩增方法。它的特异性取决于两个人工合成的寡核苷酸引物的序列。引物与待扩增片段两条链两段DNA序列分别互补，待扩增DNA在变性温度下分解为二条单链模板。在复性温度引物与模板两端的DNA序列分别复性（杂交，碱基配对）。在延伸温度和单核背酸存在的条件下，由TaqDNA聚合酶催化，引导引物的5，向3，方向延伸合成新链，是一个重复进行的热变性复性延伸的温控循环过程，随着循环次数的增加，DNA产量呈指数上升，经过20个循环以后，从微量基因材料。特异性地扩增可达数百万倍。

登革病毒含核糖核酸（RNA）基因组，因此PCR前需经过逆转录酶作用。合成第一条cDNA链（RT），再进行扩增（PCR），即RT-PCR.设计一对通用引物可扩增登革病毒组基因。设计不同型登革病毒的引物对，可扩增出不同的基因型病毒的基因产物。

B4.2材料及方法

（略）。

B4.3 意义

此法可对早期病例DV的检测及分型鉴定。