【颁布时间】1987年

【颁布部门】卫生部

【正文】

粪大肠菌群细菌来源于人和温血动物的粪便。检出粪大肠菌群表明该化妆品已被粪便污染，有可能存在其他肠道致病菌或寄生虫等病原体的危险。因此粪大肠菌被列为重要的卫生指标菌。

1方法提要

根据粪大肠菌群所具有的生物特性，如革兰氏阴性无芽胞杆菌在44℃培养24～48h能发酵乳糖产酸并产气，能在选择性培养基上产生典型菌落，能分解色氨酸产生靛基质。

2培养基和试剂

2.1乳糖胆盐培养基

成分：蛋白胨20g

猪胆盐5g

乳糖5g

0.4%溴甲酚紫水溶液2.5ml

蒸馏水1000ml

制法：将蛋白胨、胆盐及乳糖溶于蒸馏水中，调pH到7.4，加入指示剂，混匀，分装试管（每支试管中加一个小倒管）。115℃（10lb）20min灭菌。

2.2双倍浓度乳糖胆盐培养基按上述乳糖胆盐培养基成分，蒸馏水量不变，其他成分量加倍。

2.3伊红美蓝（EMB）琼脂

成分：蛋白胨10g

乳糖10g

磷酸氢二钾2g

琼脂20g

2%伊红水溶液20ml

0.5%美蓝水溶液13ml

蒸馏水1000ml

制法：先将琼脂加到900ml蒸馏水中，加热溶解，然后加入磷酸氢二钾蛋白胨，混匀，使之溶解。再以蒸馏水补足至1000ml.校正pH值为7.2～7.4，分装于烧瓶内，121℃（15lb）15min高压灭菌备用。临用时加入乳糖并加热融化琼脂。冷至60℃左右以无菌手续加入灭菌的伊红美蓝溶液，摇匀。倾注平皿备用。

2.4蛋白胨水（作靛基质试验用）

成分：蛋白胨（或胰蛋白胨）20g

氯化钠5g

蒸馏水1000ml

制法：将上述成分加热熔化，调pH值为7.0～7.2，分装小试管，高压灭菌121℃（15lb）15min.

2.5靛基质试剂

柯凡克试剂：将5g对二甲氨基苯甲醛溶解于75ml戊醇中，然后缓慢加入浓盐酸25m1.

试验方法：接种细菌于蛋白胨水中，于44℃培养24h.沿管壁加柯凡克试剂0.3～0.5ml，轻摇试管医学教`育网整理。阳性者于试剂层显深玫瑰红色。

注：蛋白胨应含有丰富的色氨酸，每批蛋白胨买来后，应先用已知菌种鉴定后方可使用。

2.6革兰氏染色法

2.6.1染液制备

2.6.1.1结晶紫染色液：

结晶紫1g

95%酒精20ml

1%草酸铵水溶液80ml

将结晶紫溶于酒精中，然后与草酸铵溶液混合。

2.6.1.2革兰氏碘液：

碘1g

碘化钾2g

蒸馏水300ml

将碘与碘化钾先进行混合，加入蒸馏水少许，充分振摇，待完全溶解后，再加蒸馏水至300m1.

2.6.1.3脱色液：95%乙醇。

2.6.1.4复染液：

a.沙黄复染液：

沙黄0.25g

95%酒精10ml

蒸馏水90ml

将沙黄溶解于酒精中，然后用蒸馏水稀释。

b.稀石碳酸复红液：称取碱性复红10g，研细，加95%乙醇100ml，放置过夜，滤纸过滤。取该液10ml，加5%石碳酸水溶液90ml混合，即为石碳酸复红液。再取此液10ml加水90ml，即为稀石碳酸复红液。

2.6.2染色法

2.6.2.1将涂片在火焰上固定，滴加结晶紫染色液，染1min，水洗。

2.6.2.2滴加革兰氏碘液，作用1min，水洗。

2.6.2.3滴加95%酒精脱色，约30s，或将酒精滴满整个涂片，立即倾去，再用酒精滴满整个涂片，脱色10s，水洗。

2.6.2.4滴加复染液，复染1min，水洗，待干，镜检。

2.6.3染色结果

革兰氏阳性菌呈紫色，革兰氏阴性菌呈红色。

注：如用1∶10稀释石碳酸复红染色液作复染液，复染时间仅需10s.

3仪器

3.1恒温水浴或隔水式恒温箱：44℃。

3.2温度计。

3.3显微镜。

3.4载玻片。

3.5接种环。

3.6电炉。

3.7锥形瓶。

3，8试管。

3.9小倒管。

3.10pH计或pH试纸。

3.11高压消毒锅。

3.12灭菌吸管。

3.13灭菌平皿。

4操作步骤

4.1取10ml1∶10稀释的样品，加到10ml双倍浓度的乳糖胆盐培养基中，置44℃培养箱中培养24～48h，如不产酸也不产气，则报告为粪大肠菌群阴性。

4.2如产酸产气，划线接种到伊红美蓝琼脂平板上，置37℃培养18～24h.同时取该培养液1～2滴接种到蛋白胨水中，置44℃培养24h.

经培养后，在上述平板上观察有无典型菌落生长。大肠菌群在伊红美蓝琼脂培养基上的典型菌落呈深紫黑色，圆形，边缘整齐，表面光滑湿润，常具有金属光泽。也有的呈紫黑色，不带或略带金属光泽，或粉紫色，中心较深的菌落。亦常为大肠菌群，均应注意挑选。

4.3挑取上述可疑菌落，涂片作革兰氏染色镜检。

4.4在蛋白胨水培养液中，加入靛基质试剂约0.5ml，观察靛基质反应。阳性者液面呈玫瑰红色医学教`育网整理；阴性反应液面呈试剂本色。

5检验结果报告

平板上有典型菌落，并经证实为革兰氏阴性短杆菌，靛基质试验阳性，则可报告被检样品中检出粪大肠菌群。

附加说明：

本标准由中国预防医学科学院环境卫生监测所归口。

本标准由“化妆品微生物标准检验方法”起草小组起草。

本标准主要起草人周淑玉。

本标准由中国预防医学科学院环境卫生监测所负责解释。