中华人民共和国国家标准化妆品微生物标准检验方法细菌总数测定UDC668：576.85.07（GB7918.2～87）细菌总数系指1g或1ml化妆品中所含的活菌，数量。测定细菌总数可用来判明化妆品被细菌污染的程度，以及生产单位所用的原料、工具设备、工艺流程、操作者的卫生状况，是对化妆品进行卫生学评价的综合依据。

本标准采用标准平板计数法。

1方法提要

化妆品中污染的细菌种类不同，每种细菌都有它一定的生理物质性，培养时对营养要求，培养温度、培养时间、pH值、需氧性质等均有所不同。在实际工作中，不可能做到满足所有菌的要求，因此所测定的结果，只包括在本方法所使用的条件下（在卵磷脂、吐温80营养琼脂上，于37℃培养48h）生长的一群嗜中温的需氯及兼性厌氧的细菌总数。

2培养基和试剂

2.1生理盐水：见GB7918-87《化妆品微生物标准检验方法总则》。

2.2卵磷脂、吐温80-营养琼脂培养基

成分：蛋白胨20g

牛肉膏3g

氯化钠5g

琼脂15g

卵磷脂1g

吐温807g

蒸馏水1000ml

制法：先将卵磷脂加到少量蒸馏水中，加热溶解，加入吐温80将其他成分（除琼脂外）加到其余蒸馏水中，溶解。加入已溶解的卵磷脂、吐温80，混匀医`学教育网整理，调pH值为7.1～7.2，加入琼脂，121℃（151b）20min高压灭菌，储存于冷暗处备用。

3仪器

3.1锥形烧瓶。

3.2量筒。

3.3pH计或精密pH试纸。

3.4高压消毒锅。

3.5试管。

3.6灭菌平皿：直径9cm.

3.7灭菌刻度吸管：10ml、2ml、1ml.

3.8酒精灯。

3.9恒温培养箱。

3.10放大镜。

4操作步骤

4.1用灭菌吸管吸取1：10稀释的检样2ml，分别注入到两个灭菌平甲内，每皿1ml.另取1ml注入到9ml灭菌生理盐水试管中（注意勿使吸管接触液面），更换一支吸管，并充分混匀，使成1：100稀释液。吸取2ml，分别注入到两个灭菌平皿内，每皿1ml.如样品含菌量高，还可再稀释成1：1000，1：10000等，每种稀释度应换1支吸管。

4.2将熔化并冷至45～50℃的卵磷脂、吐温80、营养琼脂培养基倾注平皿内，每皿约15ml，另倾注一个不加样品的灭菌空平皿，作空白对照。随即转动平皿，使样品与培养基充分混合均匀，待不琼脂凝固后，翻转平皿，置37℃培养箱内培养48h.

5菌落计数方法

先用肉眼观察，点数菌落数，然后再用放大5～10倍的放大镜检查，以防遗漏。记下各平皿的菌落数后。求出同一稀释度各平皿生长的平均菌落数。若平皿中有连成片状的菌落或花点样菌落蔓延生长时，该平皿不宜计数。若片状菌落不到平皿中的一半，面其余一半中菌落数分布又很均匀，则可将此半个平皿菌落计数后乘2，以代表全皿菌落数。

6菌落计数及报告方法

6.1首先选取平均菌落数在30～300之间的平皿，作为菌落总数测定的范围医`学教育网整理。当只有一个稀释度的平均菌落数符合此范围时，即以该平皿菌落数乘其稀释倍数（见表中例1）。

6.2若有两个稀释度，其平均菌落数均在30～300个之间，则应求出两者菌落总数之比值来决定。若其比值小于或等于2应报告其平均数，若大于2则报告其中较小的菌落数（见表中例2及例3）。

6.3若所有稀释度的平均菌落数均大于300个，则应按稀释度最高的平均菌落数乘以稀释倍数报告之（见表中例4）。

6.4若所有稀释度的平均菌落数均少于30个，则应按稀释度最低的平均菌落数乘以稀释倍数报告之（见表中例5）。

6.5若所有稀释度的平均菌落数均不在30～300个之间，其中一个稀释度大于300个，而相邻的另一稀释度小于30个时，则以接近30或300的平均菌落数乘以稀释倍数报告之（见表中例6）。

6.6若所有的稀释度均无菌生长，报告数为每克或每毫升小于10个。

6.7菌落计数的报告，菌落数在10以内时，按实有数值报告之，大于100时，采用二位有效数字，在二位有效数字后面的数值，应以四舍五入法计算。为了缩短数字后面零的个数，可用10的指数来表示（见下表报告方式栏）。在报告菌落数为“不可计”时，应注明样品的稀释度。

细菌计数结果及报告方法附加说明：

本标准由中国预防医学科学院环境卫生监测所归口。

本标准由“化妆品微生物标准检验方法”起草小组起草。

本标准主要起草人周淑玉。

本标准由中国预防医学科学院环境卫生监测所负责解释

注解：

（1）操作注意事项

1）尽量使菌细胞分散开，使每个菌细胞生成一个菌落，否则将会导致重大的技术误差。

2）制成供试液后，应尽快稀释，注皿。一般稀释后应在1小时内操作完毕。

3）注意抑菌现象。由于防腐剂未被中和，往往使平板计数结果受影响，如低稀释时菌落少。而高释释度时菌落数反而增大。

4）对照试验。化妆品的稀释液（特别是1：1O的稀释液）常带有化妆品颗粒，有时与菌落很难区分，为了避免与细菌菌落发生混淆，可作一个检样稀释液与琼脂混合的平板，不经培养放到4℃环境中，以便计数检样菌落时用作对照。

另一种防止化妆品颗粒与菌落混淆的方法是培养基中加TTC

（2）细菌总数其他测定法

1）改良的细菌总数测定法一TTC法

化妆品一般由多种物质混合而成，在进行细菌测定前虽然经过处理，但有时还会存在极难溶解的颗粒，特别是粉类化妆品和某些膏霜类化妆品。化妆品在前处理时有气泡产生，颗粒和气泡容易与细菌菌落相混，影响计数的准确性。

方法：在已熔化的卵磷脂吐-80营养琼脂中，按100ml加入1m10.5%的氯化三苯四氮唑（2，3，5triphenyiterazoloride，TTC）水溶液之量加入，操作方法同标准法。培养后如系化妆品的颗粒，不见变化，如为细菌，则生成红色菌落。配好的含TTC培养基，应先用未加TTC的对照，以观察其计数是否有不利影响（TTC在一定浓度下对革兰氏阳性菌有抑制作用）。

TTC溶液要放冷暗处保存，以防受热与光照而发生分解。TTC溶液在使用前应在水浴中煮沸半小时。

原理：无色的TTC是作为受氢体加入培养基中，如果有细菌存在，培养后在细菌脱氢酶的作用下，TTC便接受氢而成为红色的三苯基甲*（*表示月、牙、牙和日组成的字，因无此字）（fomazan），使菌落呈现红色，其反应式见结构图：

2）平板表面涂布法

将培养基制成平板，经干燥后，于其上滴加检样稀释液0.2ml，用“L‘形玻璃棒涂布于整个平板的表面，放置片刻（约10分钟）将平板翻转，放入37℃温箱内培养48小时，取出进行菌落计数，然后乘以5，即为1ml稀释样中的菌落数，再乘以稀释倍数，即得每克（或每毫升）检样所含菌落数。