【实验目的】

1. 学习考马斯亮蓝（Coomassie Brilliant Blue ，CBB）法测定蛋白质浓度的原理和方法。

2. 学会标准曲线的制作方法。

【实验原理】

考马斯亮蓝G-250存在两种不同的颜色形式，红色和蓝色。它和蛋白质通过范德华力结合，在一定蛋白质浓度范围内，蛋白质和染料结合符合比尔定律（Beer?蒺s law）。此染料与蛋白质结合后颜色由红色形式变为蓝色形式，最大光吸收由465nm变成595nm，通过测定595nm处光吸收的增加量可知与其结合蛋白质的量。

蛋白质和染料结合是一个很快的过程，约2min即可反应完全，呈现最大光吸收，并可稳定1h，之后蛋白质和染料复合物发生聚合并沉淀出来。蛋白质和染料复合物具有很高的消光系数，使得在测定蛋白质浓度时灵敏度很高，在测定溶液中含蛋白质5μg/mL时就有0.275光吸收值的变化，比Lowry法灵敏4倍，测定范围为10～100μg蛋白质，微量测定法测定范围是1～10μg蛋白质。此反应重复性好，精确度高，线性关系好。此方法干扰物少，研究表明：NaCl，KCl，MgCl2，乙醇，（NH4）2SO4无干扰。强碱缓冲液在测定中有一些颜色干扰，这可以用适当的缓冲液对照扣除其影响。

考马斯亮蓝(CBB) 法由于方法简单, 显色剂单一, 反应迅速等更被常用。但对于大批量而蛋白质含量又少的样品测定, 常量法 (MC) 测定比较费时、费试剂, 且CBB与蛋白质结合物易吸附在比色杯上, 不易清洗, 重复使用会影响测定结果。因此, 我们建立了考马斯亮蓝酶联免疫检测仪微盘比色测定法(MPC)。

【实验试剂与器材】

1. 仪器 试管，试管架，移液管（0.1ml及5ml），移液器(10μl可调, 200μl可调)，玻璃均浆器，眼科剪，镊子，天平，分光光度计，96孔板，酶联免疫检测仪。

2. 试剂及其配制

（1）考马斯亮蓝试剂 考马斯亮蓝G 250 100mg溶于50ml 95%乙醇中，加入100ml 85%磷酸，用蒸馏水稀释至1000ml，用滤纸过滤避光保存备用。

（2）标准牛血清白蛋白(BSA)溶液 蛋白浓度为0.5g／l, 以生理盐水配制。

（3）生理盐水。

【实验方法与步骤】

1. 样品制备 颈椎脱臼处死小鼠，剖腹取小鼠肝组织,用生理盐水制成5g／L的匀浆。如有块状不溶物，会造成加样误差，应先以500 rpm离心5min，取上清液备用。

2. 标准曲线的绘制

常量法:

在试管中分别加入BSA标准液: 12. 5， 25， 50， 75， 100， 125， 150 μl (即含BSA分别为6. 25， 12. 5， 25， 37. 5， 50， 62. 5， 75μg) ， 然后分别加生理盐水补充使其体积为200μl，空白管加200μL 生理盐水， 混匀后各加考马斯亮蓝显色液4000μl，摇匀， 室温放置5 min 后， 在595 nm比色测光密度。

微量法:

在96 孔板中分别加入BSA 标准液1. 25， 2. 50， 3. 75， 5. 00， 6. 25， 7. 50 μL (含BSA 分别为0. 625， 1. 250， 1. 875， 2. 500， 3. 125， 3. 750 μg)，再用生理盐水补充使每孔液体体积为10 μl， 空白孔只加生理盐水10 μl， 慢慢摇匀后，分别各加CBB 显色液200μl摇匀， 室温放置5 m in 后， 在酶联免疫测定仪600 nm 直接测定吸光度。将各自测定的结果在作直线回归，并作图。

3. 样品蛋白含量测定

测定方法同上，取合适体积的未知样品液，使其测定值在标准曲线的直线范围内。根据分别所测定的A595nm，600 nm值，从回归方程计算出未知样品的蛋白质浓度（mg/mL）。

4. 从测定结果计算出样品的蛋白质浓度,并用统计学方法说明两种测定方法的相关性。

【注意事项】

1. Tris，乙酸，2－巯基乙醇，蔗糖，甘油，EDTA及微量的去污剂如Triton X-100，SDS，玻璃去污剂有少量颜色干扰，用适当的缓冲液对照很容易除掉。但是，大量去污剂的存在对颜色影响太大而不易消除。

2. 如果测定要求很严格，可以在试剂加入后的5～20min内测定光吸收，因为在这段时间内颜色是最稳定的。

3. 测定中，蛋白－染料复合物会有少部分吸附于比色杯壁上，对测定结果会有一定的影响,所以常量法每测定完一样品后要用乙醇将蓝色的比色杯洗干净。

4. 如有全波长的酶联免疫检测仪,测定波长就选600nm。

思 考 题

1. 考马斯亮蓝微盘比色法测定蛋白质的原理是什么?

2. 如何避免测定误差?

3. 试比较两种测定方法的优缺点。