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1.抗原抗体的比例 是浊度形成的关键因素。
形成的IC分子小,而且会发生再解离,使浊度反而下降,光散射亦减少,这就是高剂量钩状效应。当抗体过量时,IC的形成随着抗原递增而增加,至抗原、抗体最适比例处达最高峰,这就是经典的海德堡曲线理论。
在反应体系中需保持抗体适当过量,如形成抗原过量则造成测定的准确性降低。
2.抗体的质量 对免疫比浊测定法的抗体要求
(1)特异性强
(2)效价高:低效价(<1:20)抗体会增加非特异性浊度(伪浊度)的产生。
(3)亲和力强:则抗体的活性高,可加快抗原抗体反应的速度,且形成的IC较牢固,不易发生解离。
(4)R型和H型抗体:
R型抗体是指以家兔为代表的小型动物被注射抗原免疫后制备的抗血清。这类抗血清的特点是亲和力较强,抗原抗体结合后不易发生解离。
H型抗体是指以马为代表的大型动物注射抗原后制备的抗血清,这类抗血清的亲和力弱,抗原抗体结合后极易解离。
3.抗原抗体反应的溶液
反应液最适pH为6.5~8.5。常使用磷酸盐缓冲液作为免疫比浊法的反应液。
在一定范围内,离子强度大,IC形成越快。
4.增浊剂
某些非离子型亲水剂对促进IC的形成有显著的增强作用,如聚乙二醇(PEG)、吐温-20,其作用是消除蛋白质(抗原或抗体)分子周围的电子云和水化层,促进抗原、抗体分子靠近,结合形成大分子复合物。
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