一、肝细胞死亡的发生机制

　　肝细胞死亡超过了肝脏的再生能力，即会发生肝衰竭。经典的肝细胞死亡模式分为两类，即坏死与凋亡。坏死往往继发于各种肝损伤所导致的ATP 耗竭，细胞肿胀溶解，导致胞内容物的释放和继发性炎症反应的发生。凋亡为ATP 依赖的程序性细胞死亡方式，其细胞因皱缩而独立出来，染色质固缩，DNA 断裂成规律性片段，并被胞膜包绕形成凋亡小体，后者可由邻近巨噬细胞吞噬，以最大限度的减轻细胞内容物的渗漏和炎症反应。长期以来，坏死与凋亡被认为是两种截然不同的现象，但在肝脏病理中我们可以观察到肝细胞的坏死与凋亡是并存的。研究证据提出新的观点，坏死与凋亡是源于相同启动因素和信号转导途径的不同的细胞死亡方式，这一过程被命名为坏死性凋亡。

　　细胞肿胀是坏死早期最为显著的特征。在ATP 耗竭后，肝细胞骨架蛋白的形态结构发生改变，促成浆膜大泡的形成。随即出现以线粒体去极化、溶酶体破裂、双向阴离子荧光团泄漏及浆膜大泡肿胀加剧为特征的亚稳态。该状态持续几分钟后浆膜大泡破裂，导致浆膜渗透压屏障不可逆的损伤，各种跨膜电子、离子梯度的断裂，以及溶质酶和代谢中间产物的渗漏，最终细胞失去活性。与其它高需氧的组织器官类似，肝脏对供血不足引起的损伤极为敏感。其中低流量性缺血，即血供被完全阻断时，整个肝脏将处于缺氧状态。而低流量性缺氧，即仍有血供但不足以满足氧需时，肝小叶中央区域而非周边区域将发生缺氧。由于肝脏具有双重血供系统，由低流量性缺氧造成的中央区域肝细胞的坏死是更为常见的现象。

　　缺血-再灌注损伤发生于肝脏的缺血-再灌注损伤可分为两个阶段，第一阶段反映了直接的肝细胞损伤，第二阶段则涉及到天然免疫系统的激活，特别是缺血后肝脏枯否氏细胞的活化，以及中性粒细胞、淋巴细胞的炎性浸润。目前认为，当缺血、缺氧发生时，由于ATP 通过氧化磷酸化途径的合成障碍，肝脏细胞基本丧失活力，但随之发生的酸中毒会使细胞的坏死延迟数个小时，直至再灌注完成后，组织的pH 值恢复正常，细胞即发生肿胀坏死。多项研究表明，在经历热缺血或冷缺血后，肝细胞与内皮细胞对pH 值依赖的坏死途径极其敏感。在肝细胞的体外热缺血-再灌注损伤模型中，通过共聚焦显微镜观察到在pH 值修复后，大量MPT 通道被诱导开放，线粒体发生严重肿胀。随后在Caspase 级联反应激活之前，ATP 即已耗竭并引发肝细胞急剧肿胀坏死。体内肝脏发生缺血-再灌注损伤后，其急性阶段也主要表现为肝细胞的坏死，组织学评价凋亡细胞的发生率仅为2%.但也有其他的观点认为缺血-再灌注损伤后，肝细胞的凋亡和坏死是并存的，损伤的强度和持续时间决定了细胞的死亡方式，即严重的损伤会导致早期发生的肝细胞坏死，而轻度的损伤则发生延迟的凋亡反应。

　　免疫凝血途径诱导的肝细胞坏死。肝细胞的广泛坏死、网状支架塌陷及大量炎性细胞浸润是重型病毒性肝炎的主要病理学改变，此外其肝窦及血管腔内广泛微小血栓的形成也是值得我们关注的又一病理生理学特征。本研究组即针对这一特征经过深入系统的研究，克隆到与微循环障碍和肝细胞坏死密切相关的新的凝血酶原酶分子——fgl2 凝血酶原酶。fgl2 凝血酶原酶属于纤维蛋白原超家族，由活化巨噬细胞或内皮细胞产生，可直接催化凝血酶原转变为有活性的凝血酶，从而快速启动凝血过程，促使纤维蛋白原转化为纤维蛋白，促进血栓形成。研究发现fgl2 凝血酶原酶在人或小鼠重型病毒性肝炎的外周血PBMC 和肝组织中均有特异性的高表达，并与疾病的严重程度正相关。提示活化巨噬细胞（内皮细胞）/fgl2凝血酶原酶介导的免疫凝血途径可通过促进肝脏纤维素沉积和微血栓形成引发肝脏的微循环障碍，最终肝细胞缺血缺氧，ATP 合成障碍而触发肝细胞坏死的发生。至此，fgl2 凝血酶原酶的发现和相关研究对重型病毒性肝炎肝细胞坏死的分子机制提出了全新的见解，也为指导临床预测患者转归、判断治疗效果，开辟新的药物和基因治疗途径提供了理论基础和靶目标。

　　2. 凋亡

　　凋亡的触发分为外源性途径和内源性途径，均通过激活Caspase 级联反应来启动凋亡程序。死亡受体/配体通路在凋亡诱导的外源性途径中占有重要地位，以DNA 损伤、p53 基因激活为代表的氧化应激反应则是内源性凋亡途径的始动因素。死亡受体属于肿瘤坏死因子/神经生长因子受体超家族，为包括胞外配体结合区域、跨膜区域和胞内死亡结构域三大部分的跨膜蛋白。目前认为在肝脏发挥重要作用的死亡受体主要包括Fas、TNF-R1 、TRAIL-R1/ TRAIL-R2 等，后者与相应的配体FasL、TNF-α 和TRAIL 结合后可诱导受体发生寡聚化并激活，其胞内的死亡结构域与相应的连接蛋白相互作用进而触发凋亡的级联反应。

　　Bcl2 家族蛋白，包括促凋亡因子与抗凋亡因子，是控制线粒体释放致凋亡因子的主要调节因素。作为Bcl-2 家族中促凋亡BH3-only 蛋白亚类的成员之一，Bid 蛋白在胞浆可被Caspase8 酶切激活形成tBid 并转位至线粒体，最终通过含多个死亡区域的促凋亡因子Bax/Bak 直接与线粒体作用，影响其外膜的通透性、细胞色素 C 及其它促凋亡因子的释放，诱导细胞凋亡的过程。抗凋亡因子诸如Bcl-2、Bcl-xL 及Mcl-1 等则可能通过与Bax 及Bak 形成异源性二聚体阻断凋亡效应的发生。

　　2.1 Fas/Fas-L 途径

　　Fas 在肝细胞具有广泛的表达，主要定位于高尔基复合体及其反面的网络结构。在经历毒性物质如胆汁酸刺激后，大量Fas 会转位至肝细胞浆膜。人或小鼠肝细胞在给予拮抗性Fas 抗体后会出现大面积的凋亡。在暴发性肝衰竭患者中，亦可观察到肝细胞Fas 的强阳性表达，肝脏炎性浸润淋巴细胞、外周淋巴细胞上Fas-L 及血清可溶性Fas-L 水平的大量上调。体外研究表明，增加的铜载量可诱导肝细胞的凋亡，而抗Fas-L 中和性抗体能起到一定的干预作用，提示了Fas/Fas-L 途径在Wilson‘s 疾病中的作用。在HELLP 综合征（溶血、肝酶升高和低血小板计数）中，有证据发现源于胎盘的Fas-L 是诱导肝损伤的始动因素。此外，Fas/Fas-L 途径在酒精性肝炎、多种药物诱导的急性肝衰竭的发生发展中亦占有重要的地位。

　　2.2 TNF-α/TNF-R1 信号

　　正常肝细胞中TNF-R1 的表达水平很低，但各种急慢性肝脏疾病中，TNF-R1 会在肝实质细胞、血窦内皮细胞和炎性浸润细胞中大量表达。TNF-α 信号途径与Fas-L 信号途径具有交叉重叠之处，包括Caspase8 的激活、Bid 的切割以及细胞色素C 的释放等。不同之处在于除了诱导凋亡途径，TNF-α还能通过核转录因子κB（NF-κB）依赖的基因表达途径促进肝细胞的增殖，在肝细胞的再生中起重要作用。研究表明，NF-кB 可通过下调c-Jun 氨基端激酶（JNK）与激活蛋白1（AP-1）来抵御TNF-α 诱导的凋亡反应。TNF-α 诱导产生的活性氧簇则具有抑制JNK 钝化磷酸酶的功能，可促进JNK 途径的持续活化，细胞色素C 的释放及Caspase3 的激活。抗氧化治疗能够阻断TNF-α 诱导的暴发性肝衰竭，但不影响肝细胞的再生功能。目前关于TNF-α 在人与小鼠暴发性肝衰竭发生发展中的作用已有相当的阐述， TNF-α 被认为是缺血性肝损伤中肝细胞凋亡的重要诱导因素。在酒精性肝炎患者中，其血清中TNF-α 与TNF-R1 的水平亦显著升高并与患者死亡率相关。

　　2.3 TRAIL 配体/TRAIL 受体

　　尽管TRAIL 介导的细胞凋亡途径已被阐明，但其是否与Fas-L、TNF-α 途径一样在急性肝衰竭的疾病进程中发挥重要作用尚不明确。体内外研究表明正常肝细胞对于TRAIL 介导的凋亡反应耐受，而慢性病毒感染、脂肪变性及毒性物质的刺激却可上调肝细胞TRAIL 的表达，进而通过TRAIL 配体/受体系统特异性清除病毒感染的肝细胞或肝癌细胞。TRAIL 配体/受体途径对于肝细胞选择性诱导凋亡的作用为病毒性肝炎与肝胆管系统恶性肿瘤的治疗提供了潜在的治疗靶点。

　　3. 坏死性凋亡

　　线粒体是细胞生命活动的控制中心，它不仅是细胞呼吸链和氧化磷酸化的中心，而且是细胞坏死与凋亡的调控中心。尤其对于肝细胞，其死亡受体介导的Caspase8 活化不能达到很高的水平，凋亡信号需要借助线粒体途径细胞色素C 的释放来放大。细胞色素C 的释放机制尚存争议，MPT 是公认的重要途径之一。缺血/再灌注损伤、死亡受体激活，以及活性氧簇均能促进MPT 的开放，后者可引发线粒体去极化与氧化磷酸化解耦联过程，线粒体发生严重肿胀至外膜破裂释放细胞色素C 至胞液。细胞色素C 再与凋亡诱导因子-1 相互作用顺序激活Caspase9 及Caspase3.这一过程中，ATP是决定坏死或凋亡发生的关键因素。当再灌注损伤导致广泛的MPT 快速发生并累及多数线粒体时，细胞ATP 浓度很快下降至耗竭，肝细胞凋亡途径被阻断而发生坏死。在对乙酰氨基酚诱导的急性肝衰竭中，如果消耗的ATP 能够通过糖酵解途径得以补偿并足以激活特异性蛋白酶时，细胞的凋亡反应被诱导，反之则发生坏死。因此，现有观点认为，坏死与凋亡是源于相同启动因素和信号转导途径的可以相互转化的两种细胞死亡方式，即坏死性凋亡，线粒体功能损伤在这一过程中起到关键的连接作用。

　　二. 重型肝炎的分子免疫治疗

　　随着分子生物学技术特别是基因工程学的发展，分子免疫（重点介绍基因治疗）治疗作为治疗新策略，已显示出广阔的应用前景。基因治疗是将具有治疗价值的基因分子通过载体导入人体细胞中，直接进行表达，抑制、替代或补偿缺陷基因，以达到防治或减轻疾病的目的。基因治疗的主要问题是寻找一种合适的载体特异有效地将目的基因输送到靶细胞，在重型肝炎的基因治疗中常用腺病毒作为载体，这主要是因为腺病毒载体对肝脏具有亲嗜性，能介导目的基因主要在肝脏表达从而发挥作用。重型肝炎的基因治疗策略主要有以下三个方面：

　　（1）基因水平上抑制肝细胞的凋亡：上述大量研究表明，免疫学异常是重型肝炎发病机制的主要环节，而TNFα和FasL 诱导的肝细胞凋亡则是其中的重要通路，如果能调控上述分子的表达，就有可能控制重型肝炎的免疫病理过程，抑制肝细胞的凋亡。Song E 等利用近年来新兴起的RNA 干扰（RNA interference，RNAi）技术，设计合成针对Fas 的siRNA，在抗Fas 抗体诱导的小鼠暴发性肝炎模型中，尾静脉高压注射（hydrodynamictail vein injection）Fas siRNA，结果表明，治疗组82%的暴肝小鼠存活超过10 天，对照组三天内全部死亡。治疗组小鼠肝组织损伤明显减轻，肝细胞凋亡及炎性细胞浸润减少，肝细胞中Fas mRNA水平降低，Fas 蛋白表达减少。

　　（2）调节某些细胞因子的表达：Nakayama Y 等人将腺病毒编码的CTLA-4Ig （AdCTLA-4Ig） 注入LPS 诱导的暴肝小鼠体内，发现治疗组小鼠全部存活，肝出血性损伤及血清转氨酶显著降低，CD4+ T 细胞活化功能受到抑制，肝脏中γ干扰素（interferon-gamma，IFN-γ）及白介素12（interleukin-12，IL-12）等细胞因子的表达降低，该实验表明导入AdCTLA-4Ig可调节暴发性肝炎小鼠体内IFN—γ、IL-12 等细胞因子的表达，有利于肝损伤的恢复。

　　（3）阻断凝血级联反应：研究证明纤维介素蛋白（又称fgl2 凝血酶原酶，fibroleukin/fibrinogen-likeprotein 2， fgl2）能直接激活凝血酶原启动凝血过程，通过对重型肝炎患者和动物模型的研究，发现在重型肝炎过程中，肝内枯否细胞及内皮细胞高表达fgl2 激活凝血酶，导致局部微循环障碍，最终导致肝细胞大量坏死[38~40].本实验室通过构建mfgl2 反义质粒成功阻断了鼠3 型肝炎病毒（mouse hepatitis virus type 3，MHV-3）诱导的重型肝炎小鼠体内mfgl2 的表达水平，减轻了小鼠肝组织病理损伤，减少炎性细胞的浸润和纤维蛋白的沉积，使小鼠生存率提高了33.3%.随着重型肝炎分子机制研究的不断深入，从分子水平上治疗重型肝炎成为了一种全新的治疗方法，其治疗效果在动物实验上得到体现。但基因治疗在研究和实践中还存在着若干问题：如导入基因的稳定表达问题，导入基因的安全性问题，基因治疗的靶向性问题，等等，可见基因治疗若用于临床，同样有一段很长的路要走。