【摘要】目的： 了解临床分离的革兰阴性杆菌中产ESBLs的流行特征及ESBLs基因型。

　　方法： 对我院临床分离的革兰阴性杆菌，采用改良三维试验检测产 ESBLs 菌株，用PCR对 ESBLs 基因进行分型。 结果： 175株革兰阴性杆菌分离出49株产ESBLs 菌，阳性率28%，包括大肠埃希菌、克雷伯菌属、阴沟肠杆菌、弗劳地枸椽酸杆菌、铜绿假单胞菌、鲍曼不动杆菌。 其中，第一位是阴沟肠杆菌（34.7%，17/49），其次是大肠埃希菌（30.6%，15/49）。 每种细菌产ESBLs率前三位是阴沟肠杆菌（56.6%，17/30），大肠埃希菌（37.5%，15/40），肺炎克雷伯菌（25.0%，6/24）。 各病区中神经科产ESBLs菌分离率最高（32.7%）。 49株产ESBLs 菌携带TEM， SHV， CTXM分别为34，5，16株，有17株同时携带两种β内酰胺酶基因的菌株，占34.7%， 其中TEM+CTXM型13株，占基因双阳性菌株的76.5%。

　　 结论：我院产ESBLs菌以阴沟肠杆菌、大肠埃希菌为主。 神经科是主要产ESBLs菌的病区。 ESBLs基因以 TEM 型、CTXM 型为主，携带双基因的菌株在我院有流行。

　　【关键词】  革兰阴性杆菌 β内酰胺酶类 三维试验 基因型

　　0.引言

　　超广谱β内酰胺酶（ Extendedspectrum betalactamases， ESBLs）是质粒介导的由β内酰胺酶（BLA）基因突变而形成的一类酶，是丝氨酸蛋白酶的衍生物。 它可水解头孢噻肟（CTX），头孢他啶（CAZ）等三代头孢菌素和单环酰胺类抗生素，并可被β内酰胺酶抑制剂（如克拉维酸）抑制［1］。 自1983年德国首次从臭鼻克雷伯杆菌中分离出SHV2基因型ESBL以来，其数量及种类已在世界各地迅速增长。 ESBLs基因型主要分为SHV，TEM，CTXM，OXA型和其他型，目前已发现200多种。 不同的国家、地区、医院因其使用抗生素的种类和剂量不同，产ESBLs细菌的检出率、耐药性、基因型也有所差异。 为了解兰州大学第二医院革兰阴性杆菌产ESBLs的流行状况和基因分型，我们对49株革兰阴性杆菌进行了ESBLs的确认及其基因型测定。

　　1.材料和方法

　　1.1材料头孢噻肟（CTX，30 μg/片），头孢硝噻吩纸片（Nitrocefin），MH琼脂购自英国Oxiod公司；克拉维酸（山西威奇达药业有限公司）， 氯唑西林（山西博康药业有限公司 ）；TaKaRa质粒DNA纯化盒，TaKaRa PCR 扩增盒， DNA Marker D3405A，引物购自宝生物（大连）有限公司。 PCR分析仪（美国PERKIN ELMER），凝胶成像仪（德国Herolab），ABI DNA 测序仪（美国PE），电泳仪（北京六一仪器厂）。 大肠埃希菌ATCC 25922、肺炎克雷伯菌700603（卫生部临检中心）。 200505～09我院临床分离菌175株革兰阴性杆菌。

　　1.2方法

　　1.2.1改良三维试验对待测菌株利用冻融法获取粗酶提取液，滤菌器过滤后测定β内酰胺酶呈阳性待用。 将CTX纸片贴于涂布了大肠埃希菌ATCC 25922的MH平板中央，具其5 mm处用刀片向外分别切四个裂隙，在各裂隙中分别加入待测粗酶液（30 μL），粗酶液（30 μL）+克拉维酸液（2 mmol/L  10 μL），粗酶液（30 μL）+氯唑西林液（2 mmol/L  10 μL），粗酶液（30 μL）+克拉维酸液（2 mmol/L  10 μL）+氯唑西林液（2 mmol/L  10 μL），35℃过夜培养。

　　1.2.2ESBLs基因型酶（TEM， SHV， CTXM1型）PCR扩增 ① 引物设计： TEM型 T1（5′ATA AAA TTC TTG AAG ACG AAA3′），T2（5′GAC AGT TAC CAA TGC TTA ATC A3′）， 终产物1075 bp；SHV型S1（5′GGG TTA TTC TTA TTT GTC GC3′），S2（ 5′TTA GCG TTG CCA GTG CTC3′）， 终产物928 bp；CTXM1型C1（ 5′GGC CCA TGG TTA AAA AAT CAC TGC3′），C2（5′CCG TTT CCG CTA TTA CAA ACC GTC G3′） 终产物826 bp. ② 质粒提取：挑选待测菌单个菌落接种至2.5  mL含有氨苄西林（50 mg/L）的LB培养基35℃过夜培养，经23 000 g离心2 min，沉淀物采用碱裂解法提取质粒DNA. ③ 反应体系： 引物各0.25   μL， 10×PCR Buffer（+）（Mg2+PLus）5 μL，dNTP 4 μL，Taq酶0.25 μL，质粒模板2 μL，加去离子水至50 μL. ④ 反应参数：TEM型 变性94℃ 45 s，退火50℃ 45 s，延伸72℃ 1 min共30个循环；SHV型 变性94℃ 30 s，退火55℃ 30 s，延伸72℃ 1 min共30个循环；CTX–M型 变性94℃ 45 s，退火59℃ 45 s，延伸72℃ 1 min共30个循环。

　　1.2.3PCR产物测序PCR产物送宝生物（大连）有限公司，采用Sanger双脱氧链终止法测序，结果直接在GenBank中进行序列比对分析。

　　1.2.4PCR产物聚丙烯酰胺凝胶电泳PCR产物点样于40 g/L聚丙烯酰胺凝胶，以8 V/cm的电压下进行电泳30 min后，经0.5 mg/L溴化乙锭染色，凝胶置于凝胶成像仪摄像。

　　2.结果

　　2.1产ESBLs革兰阴性杆菌的菌株分布175株临床分离菌株检出49株ESBLs表型阳性菌，阳性率28%. 产ESBLs菌株中，最常见的是阴沟肠杆菌，其次是大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌，最少见的是弗劳地枸橼酸菌（表1）。 各类革兰阴性杆菌产ESBLs率最高为阴沟肠杆菌，其次是大肠埃希菌、克雷伯菌属，铜绿假单胞菌产ESBLs率最低。 表1革兰阴性杆菌产ESBLs的分离率

　　2.2产ESBLs革兰阴性杆菌的科室分布产ESBLs菌在医院各科室广泛存在，神经科中比例最高，达32.7%（表2）。 表249株产ESBLs菌的病区分布

　　2.3产ESBLs革兰阴性杆菌基因分型携带TEM型β内酰胺酶基因的菌株为34株（69.3%），携带SHV型、CTXM型基因的菌株分别为5株（10.2%）、16株（34.7%），其他型别11株（22.4%）。 其中，有17株同时携带两种β内酰胺酶基因的菌株，占34.7%，TEM+CTXM型13株（26.5%），TEM+SHV型3株（10.2%），SHV型+CTXM1株（2.0%）。 各型PCR扩增产物电泳见图1，菌株详细ESBL基因分型。

　　3.讨论

　　产ESBLs菌株主要引起医院感染和流行。 从对本院的研究表明，我院产ESBLs菌分布范围广，分离率高。 其中所占比例最高的是阴沟肠杆菌（34.7%），其次是大肠埃希菌（30.6%）。 近年来，我国各地区产ESBLs大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌分离率，一般在15%～35%左右［2］，2003年以来，部分城市已高达40%［3］。 本研究产ESBLs大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌的分离率分别是37.5%， 25%，与全国水平相当。 各地区对产ESBLs阴沟肠杆菌的分离率差异较大，佘丹阳等［4］在106株阴沟肠杆菌中发现单纯产ESBLs占10.4%（11/106），肖庆忠等［5］报告阴沟肠杆菌产ESBLs达55.2%（117/212），本院阴沟肠杆菌产ESBLs率高达56.6%，与广州地区相似，可能与本院菌株分布，用药种类不同或存在局部流行有关。

　　我院多个科室中均分离到ESBLs菌，表明全院面临产ESBLs菌感染的威胁，应引起高度重视。 其中，ESBLs菌在神经科最常见（32.7%）。 推测原因神经科入住的危重患者多，第三代头孢菌素使用量较大，在抗生素的选择性压力下，导致了ESBLs产生株增多。

　　PCR结果表明本院产ESBLs革兰阴性杆菌主要产TEM型β内酰胺酶，以大肠埃希菌和阴沟肠杆菌为主，其次是CTXM型，主要集中于阴沟肠杆菌。 本院SHV型β内酰胺酶少见，主要由克雷伯菌属产生。 产TEM型、CTXM型β内酰胺酶在鲍曼不动杆菌检出，但不排除存在其他型别的可能。 李蓉等［6］检测15株鲍曼不动杆菌主要为 TEM 型、PER 型β 内酰胺酶基因和 OXA23 型碳青霉烯酶基因。 本研究中三株铜绿假单胞菌均不含blaTEM， blaSHV， blaCTX，说明可能为其他型别，有待进一步研究。 有报道，铜绿假单胞菌最常见为PER型［3］。 值得关注的是，本院产ESBLs菌TEM， SHV， CTX基因双阳性的比率达34.7%，表明产ESBLs菌携带两种β 内酰胺酶耐药基因是我院的流行特点。 其中，阴沟肠杆菌TEM型和CTXM型阳性占52.9%（17/9），多个耐药基因的存在造成阴沟肠杆菌的耐药谱扩大［7］。 北京张永利等［8］在12株阴沟肠杆菌中检出5株同时携带blaTEM， blaCTX，推测产 ESBLs 菌可通过质粒进行细菌间耐药基因的交换，同一菌株质粒上有2种或2种以上ESBLs编码基因。［医学教　育网 搜集整理］

　　本研究我们发现CTXM型β内酰胺酶在我院有流行，具有重要的意义。   国内报道产ESBLs的大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌的基因型主要是CTXM型［9］，与我国头孢噻肟用量多于其他三代头孢菌素有关。 我院头孢噻肟的用量也有此特点。 CTXM型ESBLs菌株可通过转座子从染色体转移至质粒，并通过质粒使耐药性广泛传播，从而存在爆发流行的潜在性。 因此，临床要避免滥用抗生素，重视细菌耐药的检测，控制耐药菌株的传播，减少医院感染的发生。

　　【参考文献】

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　　［4］ 佘丹阳，刘又宁。AmpC酶和超广谱β内酰胺酶在阴沟肠杆菌中的表达及其耐药性的影响［J］。中华医学杂志，2002，2：211-214。

　　［5］ 肖庆忠，苏丹虹，江洁华，等。 广州地区3 500株革兰阴性杆菌TEM和SHV型超广谱β内酰胺酶基因分型研究［J］。中华检验医学杂志，2005，28（10）：1010-1014。

　　［6］ 李蓉，李文林，石小玉，等，产ESBLs鲍曼不动杆菌的耐药特性、质粒谱及耐药基因型［J］。 中国抗生素杂，2006，31（4）：202-205。

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　　［9］ 季淑娟，顾怡明，谭文涛。中国部分地区大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌超广谱β内酰胺酶基因型研究［J］。中华检验医学杂志，2004，27（9）：590-593.