【关键词】  血管内皮生长因子类；P33ING1；胃肿瘤；免疫组织化学

　　Relationship  of vascular endothelial growth factor and p33ING1 with biological behaviors of gastric carcinoma

　　LIANG QiLian， CHEN XiaoDong， WANG SanMing， LI JianWen， ZHENG ZhaoHui， HUANG Bing

　　Oncology Center， Affiliated Hospital，  Guangdong Medical College， Zhanjiang 524001， China

　　【Abstract】 AIM： To study the expressions of vascular endothelial growth factor（VEGF） and P33ING1  in  gastric carcinoma， and their relations to the clinicopathological features. METHODS： VEGF  protein and P33ING1 protein expressions in 102 cases of human gastric carcinoma tissues and normal tissues around the foci were examined by using immunohistochemistry. RESULTS： The expression of VEGF was high in carcinoma tissues while low in normal tissues（χ2=68.0， P<0.01）， as for P33ING1， the patter  was contrary（χ2=40.3， P<0.01）。 The expression of VEGF was related to serosa invasion， TNM stage， lymph node metastasis and 5year survival rate （P<0.05）。 There was a close relation between the expression of P33ING1 and tumor location， serosa invasion， TNM stage， lymph node metastasis and 5year survival rate （P<0.05）。 CONCLUSION：  VEGF and P33ING are positively correlated with biological behaviors of gastric carcinoma， suggesting that examination by using immunohistochemistry  for  VEGF and P33ING1 may be of value in making diagnosis， evaluating evolution of disease in patients with gastric carcinoma at the same time.

　　【Keywords】  vascular endothelial growth factors； p33ING1；  stomach neoplasm； immunohistochemistry

　　【摘要】 目的： 研究血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor， VEGF）和抑癌基因P33ING1蛋白表达与胃癌临床特征之间的关系。 方法： 采用免疫组化法检测102例胃癌患者手术切除的癌组织和癌周正常组织中VEGF 和P33ING1表达水平。  结果： VEGF在正常组织中呈高表达，在肿瘤组织中呈低表达，两者比较差异有统计学意义（χ2=68.0， P<0.01）；P33ING1在正常组织中呈高表达，在肿瘤组织中呈低表达，两者比较差异有统计学意义（χ2=40.3， P<0.01）。 VEGF蛋白表达水平与胃癌浆膜浸润、TNM分期、淋巴结转移、5 a生存率有关（P<0.05），P33ING1蛋白表达水平与胃癌肿瘤部位、浆膜浸润、TNM分期、淋巴结转移、5 a生存率有关（P<0.05）。 结论： VEGF与P33ING1的表达和胃癌生物学行为有关，同时进行VEGF与P33ING1免疫组化法检测对胃癌患者病情判断和预后评价有一定的临床意义。

　　【关键词】 血管内皮生长因子类；P33ING1；胃肿瘤；免疫组织化学

　　0引言

　　胃癌是我国人群中常见的消化道恶性肿瘤之一，其死亡率高居恶性肿瘤死亡率前几位，然而有关胃癌发生发展确切的分子机制仍不十分清楚，其中血管生长因子及抑癌基因的影响倍受关注。 血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor， VEGF ）是目前发现最重要的血管生长因子，它与肿瘤患者预后是近几年的研究热点，P33ING1是新近克隆出来的一种抑癌基因，在人类许多肿瘤组织中发现存在P33ING1表达降低，并参与部分肿瘤的演进过程。 我们采用免疫组化方法检测VEGF和P33ING1蛋白在胃癌中的表达，探讨两者与胃癌生物学行为和预后的关系。

　　1材料和方法

　　1.1材料收集广东医学院附属医院199701/200212病理科归档的病历资料完整的102例胃癌组织标本，按全国胃癌协作组病理规范进行病理诊断和分级，在研究中，将肿瘤细分成两个组织学亚型：分化程度较好包括乳头状腺癌和管状腺癌，分化程度较差包括低分化腺癌、粘液细胞癌和印戒细胞癌，所有患者术前均未行化疗或放疗。 同时另取癌旁非肿瘤的正常组织石蜡标本为对照。 抗VEGF鼠源单克隆一抗购自福州迈新试剂公司；抗P33ING1鼠源单克隆一抗购自美国抗体诊断试剂公司，为杂交瘤培养上清，不稀释；Envision免疫组织化学试剂盒购于丹麦Dako公司。

　　1.2方法

　　1.2.1常规病理学检查所有标本均经体积分数为40 g/L甲醛固定，常规石蜡包埋切片，HE染色供病理观察。 肿瘤组织学分级参照国际胃癌组织学分级标准。

　　1.2.2免疫组化检测石蜡包埋组织以4 μm厚度连续切片，常规脱蜡至水，切片浸于50mmol/L（PH80）乙二胺四乙酸溶液中，微波抗原修复10 min，冷却至室温，充分水洗，PBS浸洗，滴加正常山羊血清封闭液，室温20 min；甩去多余液体，不洗，加入VEGF单抗或P33ING1单抗4℃过夜；PBS洗；滴加SP 9000通用型生物素标记二抗，37℃，40  min；DAB显色30 s，苏木素复染，系列乙醇脱水、透明、中性树胶封固。 DAB显色液配制：取DAB 5 mg溶于100 mL 0.05 mol/L TrisHCL（pH 7.6）中，加入300 mL/L过氧化氢10 μL，搅拌混匀后过滤（用前新鲜配制）；对照设置：正常小鼠血清代替一抗作替代对照，PBS作空白对照。

　　1.2.3阳性结果的判定和图像分析对于VEGF，在光镜下有棕黄色颗粒反应出现在细胞膜、细胞浆中均为阳性反应细胞，高倍镜下阳性细胞数占视野10%以下为阴性（-）；高倍镜下阳性细胞数占视野10%以上为有意义，计为阳性。 10%～30%为（+），30%～50%为（），>50%为（），（+）～（）均表示为阳性（+）。 对于P33ING1，在光镜下有棕黄色颗粒反应出现在细胞浆中为阳性反应细胞，高倍镜下阳性细胞数占视野25%以下为阴性（-）；高倍镜下阳性细胞数占视野25%以上为有意义，计有阳性。 25%～50%为（+），50%～75%为（），>75%为（），（+）～（）均表示为阳性（+）。

　　统计学分析：　统计学处理采用简明统计分析软件。 各组间差异用χ2检验，取α=0.05检验水准。

　　2结果

　　2.1VEGF和P33ING1蛋白在胃癌组织与癌旁正常组织中的表达情况VEGF蛋白在胃癌组织中的阳性表达率为50.0%（51/102），在癌旁正常组织中的阳性表达率为0，两者比较差异有统计学意义（χ2=68.0， P<0.01）；P33ING1蛋白在胃癌组织中的阳性表达率为53.9%（55/102），在癌旁正常组织中的阳性表达率为93.1%（95/102），两者比较差异有统计学意义（χ2=40.3， P<0.01）。

　　2.2VEGF蛋白在胃癌组织中的表达与临床病理因素之间关系（表1）结果表明VEGF蛋白表达水平与胃癌浆膜浸润、TNM分期、淋巴结转移有关（P<0.05）。

　　表1VEGF蛋白表达水平与胃癌临床病理因素的关系（略）

　　2.3P33ING1蛋白在胃癌组织中的表达与临床病理因素之间关系结果表明P33ING1蛋白表达水平与胃癌肿瘤部位、浆膜浸润、TNM分期、淋巴结转移有关（P<0.05，表2）。

　　2.4VEGF和P33ING1蛋白表达与胃癌患者预后的关系102例胃癌患者中有随访资料的93例，5 a生存率：Ⅰ期为82.7%，Ⅱ期为51.8%，Ⅲ期为13.7%，Ⅳ期为1.3%. VEGF表达阴性的患者5 a生存率明显高于VEGF表达阳性的患者，两者比较差异有统计学意义（χ2=19.4， P<0.01），前者为63.4%，后者为31.2%. P33ING1表达阳性的患者5 a生存率明显高于P33ING1表达阴性的患者，两者比较差异有统计学意义（χ2=14.6， P<0.01），前者为65.6%，后者为37.6%.

　　表2P33ING1蛋白表达水平与胃癌临床病理因素的关系（略）

　　3讨论

　　实体瘤的生长离不开新生血管，肿瘤不仅通过新生血管获取癌组织生长所必需的氧和营养物质，并通过血管浸润周围脏器发生远处转移。 血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor， VEGF）是Ferrara等［1］从牛垂体滤泡细胞培养液中分离出的一种高度特异性促血管内皮细胞有丝分裂的生长因子，是目前发现的最强烈的血管通透性因子，比组胺作用强50000倍，是Mr（34～45）×103的高度糖基化碱性蛋白，由Mr（17～22）×103的同源双聚体构成；VEGF是一种高度特异的血管内皮细胞有丝分裂素，其主要生物学功能［2］： ① 刺激血管生成；② 促进内皮细胞的增生和迁移；③ 增加血管尤其是微小血管的渗透性，使血浆大分子外渗沉积在血管外基质中，为肿瘤细胞的生长和新生毛细血管网的建立提供营养；④ 促进某些蛋白水解酶的作用使基质降解。 以上作用均有助于肿瘤的血管形成、浸润与转移。 多数实体瘤均过度表达VEGF，在某些肿瘤中已将其作为一种新的肿瘤标志物，与其他实体肿瘤一样， 胃癌的发生、发展也与肿瘤血管生成有关。 Saito等［3］研究提示VEGF表达阳性的胃癌患者的5 a生存率为33.0%，而VEGF表达阴性的胃癌患者的5 a生存率为67.6%，且经多因素分析提示VEGF为一独立的预后因素。

　　本组通过Envision免疫组织化学法测定结果表明VEGF在胃癌的肿瘤组织中的表达明显高于正常组织，且在肿瘤组织中VEGF蛋白表达强度与浆膜浸润、TNM分期、淋巴结转移、5 a生存率等呈相关性，提示VEGF可作为考量肿瘤侵袭转移能力、反映胃癌生物学行为的一个重要指标。

　　Garkavtesev等［4］采用cDNA消减杂交法（subtractive hybridization）建立了1种从富含所需序列的cDNA文库中构建较简便GSEs（genetic suppressor elements） 文库的方法，并结合体内选择技术（in vivo selection assay），成功克隆出一个新基因。 用该基因cDNA片段反向插入表达载体并转染小鼠永生化乳腺上皮细胞后，接种于裸鼠皮下可以成瘤；体外软琼脂集落形成试验，集落数至少是对照组的50倍。 所有这些结果都提示，这个基因在正常情况下对细胞的生长具有抑制作用；用反义mRNA可以阻断其作用，进细胞的生长和恶性转化，因而命名为inhibitor of growth（ING），并且由于这个基因可能是该家族的第一个成员，故而称之为ING1.

　　ING1基因定位于13q3334，其编码的蛋白质分子量为33 ku，故命名为P33ING1，在人类各种正常组织细胞内均有表达［5-7］。 P33ING1蛋白质的高表达可抑制细胞生长增殖，使细胞停滞于G0/G1期，并有促进细胞凋亡的作用［8］。 而P33ING1蛋白质表达下调，则可促进细胞的恶性转化，导致肿瘤的发生。 Tokunaga等［9］分别从蛋白和mRNA转录水平检测24例乳腺癌组织中的P33ING1 mRNA含量，相对于正常组织有17例表达下降（78.8%），原位杂交结果显示，P33ING1 mRNA在进展期乳腺癌比早期癌及癌旁组织少；祝峙等［10］用免疫组化法检测57例肝癌及癌周边正常肝组织中P33ING1蛋白，证实在肝癌组织中P33ING1白表达明显低于正常肝组织；Oki等［11］研究发现12株胃癌细胞仅1例存在P33ING1突变，15/20的胃癌组织却表现为P33ING1 mRNA显著降低，结果说明P33ING1在胃肠道肿瘤形成中其抑癌基因的作用［6］。

　　我们结果表明，P33ING1在胃癌的肿瘤组织中的表达强度明显减低，且在肿瘤组织中P33ING1蛋白表达强度与肿瘤部位、浆膜浸润、TNM分期、淋巴结转移、5 a生存率等呈相关性。 VEGF和P33ING1蛋白表达与胃癌的侵袭性生长特性有关。

　　【参考文献】

　　［1］ Ferrara N， Henzel WJ. Pituitary follicular cell secrete a novel heparinbinding growth factor specific for vascular endothelial cell［J］。 Biochem Biophys Res Commun，1989，161（2）：851-858.

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　　［3］ Saito H， Tsujitani S， Kondo A， et al. Expression of vascular endothelial growth factor correlates with hematogenous recurrence in gastric carcinoma［J］。 Surgery， 1999，125（2）：195-201.

　　［4］ Garkavtsev I， Kazarov A， Gudkov A， et al. Suppression of the novel growth inhibitor p33ING1 promotes neoplastic transformation［J］。 Nat Genet. 1996，14（4）：415-420.

　　［5］ Cheung KJ Jr， Mitchell D， Lin P， et al. The tumor suppressor candidate P33（ING1）  mediates repair of UVdamage dDNA［J］。 Cancer Res， 2001，61（13）：4974-4977.

　　［6］ Nouman GS， Angus B， Lunec J， et al. Comparative assessment of expression of the inhibitor of growth1 gene（ING1） in normal and neoplastic tissues［J］。 Hybrid Hybridomics， 2002，21（1）：1-10.

　　［7］ Nouman GS， Anderson JJ， Crosier S， et al. Downregulation of nuclear expression of the P33（ING1b） inhibitor of growth protein in vasive carcinoma of the breast［J］。 J Clin Pathol， 2003，56（7）：507-511.

　　［8］ Cheung KJ jr， Li G…… P33（ING1） enhances UVBinduced apoptosis in melanoma cells［J］。Exp Cell Res， 2002，279（2）：291-298.

　　［9］ Tokunaga E， Maehara Y， Oki E， et al. Diminished expression of ING1mRNA and the correlation with p53  expression in breast cancers［J］。 Cancer Latt， 2000，152（1）：15-22.

　　［10］ 祝峙，林静，曲建慧，等。 原发性肝细胞癌中p33（ING1b）与p53基因间协同功能的研究［J］。 中华医学杂志， 2003，83（20）：1795-1800.

　　［11］ Oki E， Maehara Y， Tokunaga E， et al. Reduced expression of P33（ING1） and the relationship with p53 expression in human gastric cancer［J］。 Cancer Lett， 1999，147（12）：157-162.