【关键词】  白藜芦醇；庆大霉素，自由基

　　Antifree radical activity of resveratrol in guinea pig cochlea

　　3Department of Otorhinolaryngology， Xijing Hospital，  Fourth Millitary Medical University， Xian 710033， China

　　【Abstract】 AIM：  To study the prevention of gentamicin （GM） ototoxicity by resveratrol （Res） in guinea pig. METHODS：  Auditory brainstem response， cochlear preparation and transmission electron microscope were used to evaluate  the effects of hair cell on hearing threshold and the morphology of hair cell. Serum levels of GM was also tested. Guinea pigs were randomly assigned to 3 groups （GMtreated alone， GM and Res in combination and one control group）。 Serum levels of superoxide dismutase （SOD）， malondialdehyde （MDA） were also tested. RESULTS： MDA concentration in serum of the GM+Res group was significantly lower than that in the GM group （P<0.05）， while SOD level was much higher than that in the GM group （P<0.05）。 Res did not alter the serum level of GM. Morphological results were consistent with functional changes. The worst damages occurred in the basal circles. Damages in upper circles were lighter. GM mainly impaired the outer hair cells， on which Res had protective effect. CONCLUSION： Res may be a promising therapeutic agent to clean out free radical.

　　【Keywords】 resveratrol； gentamicins； free radical

　　【摘要】 目的：观察白藜芦醇（Res）的抗自由基作用。 方法：将豚鼠随机分为3组：庆大霉素组（GM组）；Res＋GM组；空白对照组，每组动物10只。 测定听性脑干反应（ABR）、耳蜗铺片、动物血清中丙二醛（MDA）和超氧化物歧化酶（SOD）含量及GM血药浓度，观察Res对自由基的影响。 结果：GM+Res组血液中MDA较GM组明显减少（P<0.05）；GM+Res组SOD活性明显高于GM组（P<0.05）。  Res对GM的血药浓度无影响。 耳蜗铺片结果显示空白对照组毛细胞排列整齐，无损伤；GM组底圈毛细胞损伤严重，向上逐渐减轻，与听阈升高的程度相平行。 而GM+Res组的毛细胞部分消失，与GM组比较损伤较轻。 结论：Res能对豚鼠体内自由基含量产生很明显的影响，对GM引起的耳毒性有保护作用。

　　【关键词】 白藜芦醇； 庆大霉素；自由基

　　0.引言

　　在氨基糖苷类药物的耳毒性机制中，自由基是目前比较完善的学说之一［1-2］。 在正常机体内会有少量的自由基存在，病理状态下，自由基含量会增加，直接造成细胞各成分损害，引起其代谢和功能障碍。 白藜芦醇（resveratrol， Res）属于非黄酮类多酚化合物，广泛存在于种子植物中。 结构中有三个酚羟基，在机体中可以竞争性结合自由基，从而减少自由基含量，达到清除自由基的作用。 中药虎杖和葡萄皮中含有大量的Res，具有很大的药用价值［3］。 丙二醛（malondialdehyde， MDA）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase， SOD）是检测自由基的重要参数。 我们将Res与庆大霉素（gentamicin， GM）用于动物后通过检测动物血清中MDA，SOD的含量以及观察听性脑干反应（auditory brainstem response， ABR）和细胞形态学的变化来研究Res对自由基的作用。

　　1.材料和方法

　　1.1材料

　　耳廓反射正常的健康雄性杂色豚鼠30只，体质量250～350 g（第四军医大学实验动物中心）；硫酸GM（西安高科陕西金方药业公司）；Res（西安交大保赛生物技术股份有限公司）；MDA，SOD试剂盒（南京建成生物工程研究所）。

　　1.2方法

　　1.2.1动物分组及处理

　　将30只豚鼠随机分为3组，每组10只。 ①GM组： 120 mg/kg皮下注射GM，1次/d，连续3 wk； ②Res＋GM组：用Res 375 mg/kg灌胃；GM 120 mg/kg皮下注射，1次/d，连续3 wk；③空白对照组：不给试验动物任何药物。 在动物实验期间每天秤体质量以调整用药量。 用药前及用药后第1，3，4和6 wk检测ABR，在用药后第1，3 wk分别取血检测血清中MDA，SOD含量及血清中GM含量；第4次测ABR后每组取2只豚鼠耳蜗，供光镜观察耳蜗铺片。

　　1.2.2ABR反应阈检测

　　豚鼠的ABR 以Ⅲ波最为显著。 动物在戊巴比妥钠40 mg/kg皮下注射麻醉后，将针型记录电极置前额正中皮下，参考电极置测试耳外耳道口后上皮下，鼻尖接地。 用Biologic 声刺激器，286计算机自动采样，采用短纯音（tone burst，上升下降时间各2 ms，平台时间1 ms） 1 kHz，8 kHz刺激，间隔75 ms，扫描时间20 ms，叠加256次，带通滤波80～1500 Hz，在屏蔽隔声室内常规测试。

　　1.2.3耳蜗硬铺片标本制备［4］

　　将动物麻醉致死，取出听泡暴露骨性耳蜗，于显微镜下在冰盒内快速摘除镫骨，刺破圆窗，挑开蜗顶； 用5～10 g/L AgNO3分别从蜗尖和蜗底圆窗反复灌注，完毕后将标本浸入5～10 g/L AgNO3液体中，置4℃冰箱15～20 min，用 25 mL/L戊二醛固定灌注标本，灌注方法同上，放入冰箱内固定2～4 h，取出标本在阳光下曝光40～60 min使标本由黄色变成黑色，再置于25 mL/ L戊二醛于4℃冰箱固定24 h，解剖显微镜下常规制备，分离各圈基底膜，甘油封片。

　　1.2.4检测血清中MDA，SOD

　　用药后19 d于各组动物心肌取血。 离心，取血清-20℃冻存。 采用MDA，SOD试剂盒，按说明操作检测。

　　2.结果

　　实验中GM组2只动物死亡，死前均消瘦、耳廓反射消失、无力。 GM+Res组有1只动物死亡。 空白对照组无死亡。

　　2.1ABR检测结果

　　用药后各组动物ABR出现阈移。 1  KHz ABR阈移：GM组（28.8±2.9）dB；Res＋GM组（5.2±2.9） dB ，两组间差异显著（P<0.01）。 8 kHz ABR阈移： GM组（40.3±3.7） dB； Res+GM组（12.4±2.2） dB，两组间差异显著（P<0.01）高频听力损失比低频重。

　　2.2用药后两组动物的耳蜗铺片比较

　　空白对照组耳蜗铺片毛细胞排列整齐，无缺失。 GM组底圈毛细胞损伤最重，底圈和第二圈外毛细胞损失严重，向上逐渐减轻，与听阈升高的程度相平行。 而Res＋GM组相对较轻。

　　2.3MDA含量和SOD活力

　　用药1，3 wk时，Res+GM组血清的MDA含量均低于GM组，差异显著（P<0.05）； GM组血清SOD活力均低于Res＋GM组（P<0.01）。

　　2.4肾功检测结果

　　用药1，3 wk时，Res + GM组血清尿素氮（BUN）和肌酐（Cr）均明显低于GM组（P<0.05，表1）。图5白藜芦醇组3 wk时毛细胞部分消失×400

　　2.5血清浓度组间血清GM浓度

　　无显著差异（P>0.05）；Res对GM的血药浓度无影响。

　　3.讨论

　　近年来，天然药物由于其毒副作用小，药物来源范围广泛等原因，在新药研制领域受到越来越多的重视和关注。 Res属于非黄酮类多酚化合物，广泛存在于种子植物中。 Res的结构中有三个酚羟基，在机体中可以竞争性结合自由基，从而减少自由基含量，达到清除自由基的作用。 而氨基糖甙类抗生素的耳毒作用机制之一为自由基学说。 此学说认为正常机体组织内有少量的自由基存在，病理状态下自由基含量会增加，其中以氧族羟基自由基为主，由于性质不稳定，氧化作用强，对膜结构的攻击最为严重，能引起膜脂质氧化，通透性增加造成细胞死亡［5-6］。 我们的结果显示Res与GM同时使用具有保护GM所致耳蜗损伤时耳蜗的SOD活性作用， 增强了内源性氧自由基清除酶的功能， 抑制脂质过氧化反应， 减少氧自由基的代谢产物MDA， 从而保护耳蜗毛细胞： 试验有Res+GM组和GM组的听阈有明显差异，SOD 和MDA的数据显示，Res+GM组和GM组有明显差异，具有统计学意义。 耳蜗铺片照片显示：GM组的毛细胞损伤情况比Res+GM组严重。 Res+GM组对耳蜗毛细胞有保护作用。 肾功检测结果也显示Res 对GM的肾毒性有保护作用，由以上结果可看出Res是一种有效的自由基清除剂并且对GM的毒性有抑制作用。 但是否具有直接清除氧自由基的作用，还有待于进一步研究。

　　【参考文献】

　　［1］Song BB， Schacht J. Variable efficacy of radical scavengers and iron chelators to attenuate gentamicin ototoxicity in guinea pig in vivo［J］。 Hear Res， 1996，94（12）：87-93.

　　［2］王锦玲，黄维国，陈阳。 水杨酸钠抗庆大霉素耳毒性作用机理研究［J］。中华耳鼻咽喉科杂志，2000，35（1）：66.

　　［3］许小燕，潘林梅。天然植物中白藜芦醇及其苷类的医疗保健作用 ［J］。 时珍国医国药，2004，15：49.

　　［4］李玉茹，刘得龙，张庆丰，等。大鼠乳鼠耳蜗基地膜的铺片研究 ［J］。 哈尔滨医科大学学报， 2004， 38（4）：336-338.

　　［5］黄巨恩，徐志文，陈纡，等。 庆大霉素毒性作用及防治新进展 ［J］。 医学综述，2002，8（9）：555-557.

　　［6］权卉，张娜。 庆大霉素的特殊不良反应 ［J］。 中国医学理论与实践，2004，14（8）：1208-1209.