【关键词】  肉苁蓉； 1甲基4苯基吡啶离子； 帕金森病； 生存率

　　帕金森病（Parkinson‘s disease， PD）是中枢神经系统进行性变性疾病。一旦出现临床症状，其黑质纹状体系统多巴胺神经元已经减少了60%～80%.尽管神经科学家采取包括左旋多巴制剂在内的各种治疗方法，但目前所有的研究都提示无法阻止其进展。生长抑制和DNA损伤诱导基因153（growth arrest and DNA damageinduced gene 153， GADD153）是调控细胞凋亡的一种重要蛋白，在细胞内质网应激等应激状态下大量表达并转位于细胞核［1］。本研究观察了肉苁蓉提取物对1甲基4苯基吡啶离子（1methyl4phenylpyridinium ion， MPP+）介导的SHSY5Y多巴胺能细胞系损伤的保护作用及对GADD153表达的影响，并探讨了其对帕金森病的神经保护作用。

　　1  材料与方法

　　1.1  材料  肉苁蓉提取物，上海市东方科技公司产品，PBS稀释成10 mg/ml，22 μm滤膜过滤灭菌；MPP+，Sigma公司产品，无菌蒸馏水稀释成4 mol/L；胎牛血清、达尔伯克改良伊格尔培养基（Dulbecco‘s modified eagle’s medium， DMEM）、胰蛋白酶，均为Gibco公司产品；GADD153小鼠抗人单克隆抗体，Santa Cruz公司产品；小鼠抗人βactin单克隆抗体，Sigma公司产品；甲基噻唑基四唑（methyl thiazolyl tetrazolium， MTT），荷兰Duchefa公司产品；反转录试剂盒（reverse transcriptasepolymerase chain reaction， RTPCR），MBI公司产品；SHSY5Y细胞，复旦大学神经生物学国家重点实验室黄芳老师惠赠。

　　1.2  实验方法

　　1.2.1  细胞培养及分组  SHSY5Y细胞每2～3 d用10% DMEM培养液换液1次。待细胞增长至80%融合时，用0.25%胰酶消化细胞，按1×105分瓶传代，置于5% CO2的细胞培养箱中。实验用细胞分为对照组、MPP+组和肉苁蓉提取物不同浓度组。用DMEM培养液将MPP+按1∶10梯度稀释成400 mmol/L，按1∶100体积比例加入96孔板或6孔板中，使MPP+终浓度分别为0.25、0.5、1、2和4 mmol/L.肉苁蓉提取物用DMEM培养液按1∶10梯度稀释成1 mg/ml与10 μg/ml两个工作浓度。按1∶100加入96孔板或6孔板中，使终浓度分别为1、10和100 μg/ml.6孔板每孔总体积为2 ml，96孔板每孔总体积为200 μl.每项相同实验均重复3次。

　　1.2.2  MTT检测细胞活性

　　1.2.2.1  MPP+对SHSY5Y细胞存活率的影响  1×104密度SHSY5Y细胞200 μl接种于96孔板，24 h后换含MPP+终浓度分别为0.25、0.5、1、2和4 mmol/L的培养液，每浓度3复孔，置于5% CO2培养箱37 ℃孵育，分别于6、12、24和48 h时各孔加入MTT 20 μl，继续孵育4 h取出培养板。吸弃培养液，每孔加入二甲基亚砜（dimethyl sulphoxide， DMSO）150 μl充分震荡10 min，待蓝色颗粒完全溶解后用全自动酶标仪（Biorad产品）570 nm处测定吸光度值。

　　1.2.2.2  肉苁蓉提取物对MPP+介导的SHSY5Y细胞损伤的影响  终浓度1 mmol/L MPP+与肉苁蓉提取物分别为1、10和100 μg/ml同时加入96孔板置5% CO2培养箱37 ℃孵育48 h.其余步骤同1.2.2.1.

　　1.2.3  RTPCR检测GADD153的mRNA表达  终浓度1 mmol/L MPP+与肉苁蓉提取物分别为1、 10和100 μg/ml，同时加入6孔板置5% CO2培养箱37 ℃孵育48 h.取出6孔培养板，PBS冲洗，按Trizol法提取总RNA.取1 μg RNA，按反转录试剂盒说明进行逆转录。聚合酶链反应总体积为25 μl.引物序列为：GADD153上游引物，5‘GCACCTCCCAGAGCCCTCACTCTCC3’；下游引物，5‘GTCTACTCCAAGCCTTCCCCCTGCG3’；βactin上游引物，5‘ATCGTGGGCCGCCCTAGGCAC3’；下游引物，5‘TGGCCTTAGGGTTCAGA GGGGC3’。扩增目的产物的长度分别为422 bp和244 bp.94 ℃预变性5 min.循环参数为：95 ℃变性0.5 min，60 ℃退火0.5 min，72 ℃延伸1 min，共35个循环。取PCR产物4 μl，电泳后拍照。

　　1.2.4  Western blotting检测GADD153蛋白表达  终浓度1 mmol/L MPP+与肉苁蓉提取物分别为1、10和100 μg/ml，同时加入6孔板置5% CO2培养箱37 ℃孵育48 h.取出6孔培养板，PBS冲洗，加入60 μl蛋白裂解液裂解，超声震荡，100 ℃变性10 min.用Lowry法测定样品蛋白浓度。电泳：积层胶60 V 30min，分离胶120 V 90 min；PVDF膜转膜110 V 100 min.加1∶50小鼠抗人GADD153单克隆抗体，4 ℃过夜。TBST溶液洗涤3次，10 min/次，加含HRP的兔抗小鼠二抗室温孵育2 h，化学发光法显影X胶片。胶片用Alpha Image 950自动扫胶系统得到条带灰度值。每个样本的免疫印迹条带均与同一样本的βactin比较后作统计学分析。

　　1.3  统计学方法  采用SPSS 11.5软件进行单因素方差分析。计量资料数据用x±s表示。

　　2  结果

　　2.1  MPP+对SHSY5Y细胞存活率的影响  不同浓度MPP+作用SHSY5Y细胞后，细胞存活率随MPP+的浓度增加而降低；MPP+ 1 mmol/L浓度状态下细胞存活率随时间增长而降低。呈现明显的量效与时效关系。见图1.其中MPP+ 1 mmol/L组在48 h存活率为（45.30±3.21）%，低于50%.故选用1 mmol/L MPP+作为制作帕金森病细胞模型的处理剂量。

　　图1  不同浓度MPP+对SHSY5Y存活率的影响（略）

　　Figure 1  Effects of different concentrations of MPP+ on cell viability of SHSY5Y

　　2.2  肉苁蓉提取物对1 mmol/L MPP+介导的SHSY5Y细胞存活率的影响  肉苁蓉提取物对MPP+介导的损伤有明显的保护作用。保护作用随浓度增加而加强。MPP+ 1 mmol/L处理的细胞48 h存活率为（45.30±3.21）%，1 μg/ml肉苁蓉提取物处理的细胞存活率为（85.97±3.41）%，10 μg/ml为（129.97±4.84）%，100 μg/ml为（164.10±3.91）%，三种浓度与MPP+ 1 mmol/L对照处理比较，细胞存活率差异有统计学意义（P＜0.01）。提示肉苁蓉提取物不仅有较好的神经保护作用，而且还可能有促进细胞增殖的作用。见图2.

　　2.3  肉苁蓉提取物对MPP+介导的帕金森病细胞模型GADD153 mRNA表达的影响  MPP+ 1 mmol/L处理SHSY5Y细胞后，在胶上观察到GADD153 mRNA水平明显较对照组明亮，统计出的结果也表明两者之间差异有统计学意义（P＜0.01）。肉苁蓉提取物组与MPP+ 1 mmol/L处理组相比，GADD153 mRNA水平不仅在胶上显示出其随着肉苁蓉提取物浓度的增加而条带逐渐变暗，对其扫描统计分析出的结果也进一步证实，肉苁蓉组GADD153的mRNA水平明显降低（P＜0.01），且这种降低明显呈肉苁蓉剂量的依赖关系。见图3.

　　图2  肉苁蓉提取物对MPP+介导的帕金森病细胞模型的保护作用（略）

　　Figure 2  Protective effect of Cistanche extracts on MPP+induced PD cellular model

　　All the three concentrations of Cistanche extracts （CE） had a protective role on the 1 mmol/L MPP+ treatment. MPP+treated cells had a lower viability vs control group， and Cistanche extracts groups exhibited higher viability vs MPP+ group. **P<0.01， vs MPP+ group； △△P<0.01， vs control group.

　　图3  肉苁蓉提取物对MPP+介导的帕金森病细胞模型GADD153 mRNA表达的影响

　　Figure 3  Effects of different concentrations of Cistanche extracts on mRNA expression of GADD153 of MPP+induced PD cellular model

　　mRNA expression of GADD153 in control group， MPP+ group （M）， Cistanche extracts 1 μg/ml  group （CE1）， 10 μg/ml group （CE2） and 100 μg/ml group （CE3）。 mRNA expression of GADD153 increased to a significant level after being treated by 1 mmol/L MPP+， while Cistanche extracts showed excellent capability of decreasing GADD153 mRNA expression.**P<0.01， vs MPP+ group； △△P<0.01， vs control group.

　　2.4  肉苁蓉提取物对MPP+介导的帕金森病细胞模型GADD153 蛋白表达的影响  MPP+ 1 mmol/L处理48 h后，Western blotting结果表明GADD153大量表达，胶片上的MPP +组印迹的着色明显较对照组深，且这个结果与扫描统计后的分析结果一致（P＜0.01），而1、10和100 μg/ml 肉苁蓉提取物却逐渐降低了GADD153蛋白的表达，且这种表达与MPP+组相比差异有统计学意义（P＜0.01）。见图4.

　　图4  肉苁蓉提取物对MPP+介导的帕金森病细胞模型GADD153 蛋白表达的影响（略）

　　Figure 4  Effects of different concentrations of Cistanche extracts on protein expression of GADD153 of MPP+induced PD cellular model

　　Expression of GADD153 protein in control group， MPP+treated cells （M）， Cistanche extracts 1 μg/ml  （CE1）， 10 μg/ml  （CE2） and 100 μg/ml  （CE3）pretreated groups. GADD153 protein expression of MPP+treated cells increased to a significant level， and Cistanche extracts pretreatment decreased the protein expression by a significant level. **P<0.01， vs MPP+ group； △△P<0.01， vs control group.

　　3  讨论

　　以往的研究表明内质网应激在帕金森病的发病机制中占有很重要的地位［2， 3］。在内质网应激过程中，ATF6，IRE1和PERK三条通路都可以直接或间接地激活GADD153，进而使正常细胞内低水平表达的GADD153过量表达并转位于细胞核，从而导致细胞凋亡［4，5］。而GADD153敲除小鼠能减少甚至阻止内质网应激和神经营养因子剥夺所导致的细胞凋亡［6， 7］。帕金森病的典型病理表现是中脑多巴胺能神经元的减少，而这种减少目前认为多与细胞凋亡有关［8］。我们的研究发现，在1 mmol/L MPP+处理SHSY5Y细胞48 h后，细胞的存活率已经低于50%，而此时GADD153的mRNA和蛋白水平与对照组相比明显增加（P＜0.01），这一结果也与Conn等［9］的发现相一致。因而GADD153的升高与细胞损伤之间有着紧密的联系。肉苁蓉提取物是从管花肉苁蓉中分离、纯化的一种化合物。中医认为肉苁蓉具有补肾阳、益精血、润肠通便的功效，主治男子阳痿、女子不孕、血枯便秘等证，有“沙漠人参”的美誉。以往的研究表明肉苁蓉可以提高多种中枢神经递质的含量，具有很强的抗氧化作用，还可延长动物寿命和抗衰老。而对肉苁蓉提取物的研究也表明肉苁蓉的提取物具有抗凋亡的作用［10~12］。本实验的MTT结果表明1、10和100 μg/ml 肉苁蓉提取物的细胞存活率均比MPP+组明显增高（P＜0.01），而且细胞存活率与肉苁蓉提取物浓度呈剂量依赖关系。因此我们的结果表明肉苁蓉提取物对MPP+介导的损伤具有保护作用。RTPCR和Western blotting的结果显示，GADD153的表达与对照组相比也明显降低。其中在肉苁蓉提取物最高浓度组（100 μg/ml ）GADD153 mRNA水平降到了最低（P＜0.01），Western blotting的结果也发现GADD153的蛋白表达同时降到了最低（P＜0.01）。基于上述结果，我们认为肉苁蓉提取物对MPP+介导的SHSY5Y细胞损伤模型的保护作用可能是通过调控GADD153来实现的。

　　【参考文献】

　　1 Oyadomari S， Mori M. Roles of CHOP/GADD153 in endoplasmic reticulum stress. Cell Death Differ. 2004； 11（4）： 381389.

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　　4 Yamamuro A， Yoshioka Y， Ogita K， et al. Involvement of endoplasmic reticulum stress on the cell death induced by 6hydroxydopamine in human neuroblastoma SHSY5Y cells. Neurochem Res. 2006； 31（5）： 657664.

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　　6 Tajiri S， Oyadomari S， Yano S， et al. Ischemiainduced neuronal cell death is mediated by the endoplasmic reticulum stress pathway involving CHOP. Cell Death Differ. 2004； 11（4）： 403415.

　　7 Tajiri S， Yano S， Morioka M， et al. CHOP is involved in neuronal apoptosis induced by neurotrophic factor deprivation. FEBS Lett. 2006； 580（14）： 34623468.

　　8 Chen J， Tang XQ， Zhi JL， et al. Curcumin protects PC12 cells against 1methyl4phenylpyridinium ioninduced apoptosis by bcl2mitochondriaROSiNOS pathway. Apoptosis. 2006； 11（6）： 943953.

　　9 Conn KJ， Gao WW， Ullman MD. et al. Specific upregulation of GADD153/CHOP in 1methyl4phenylpyridiniumtreated SHSY5Y cells. J Biol Chem. 2002； 68（6）： 755760.

　　10 Deng M， Zhao JY， Tu PF， et al. Echinacoside rescues the SHSY5Y neuronal cells from TNFalphainduced apoptosis. Eur J Pharmacol. 2004； 505（13）： 1118

　　11 Wu Y， Li L， Wen T， et al. Protective effects of echinacoside on carbon tetrachlorideinduced hepatotoxicity in rats. Toxicology. 2007； 232（12）： 5056.

　　12 Tian XF， Pu XP. Phenylethanoid glycosides from Cistanches salsa inhibit apoptosis induced by 1methyl4phenylpyridinium ion in neurons. J Ethnopharmacol. 2005； 97（1）： 5963.