【摘要】目的：复制家兔胆固醇结石模型，检测模型家兔肝组织固醇携带蛋白2（SCP2） mRNA的表达。 方法：健康北京大耳白家兔16只，随机分为2组，每组8只：对照组喂普通饮食，模型组喂高胆固醇饮食（含12 g/kg胆固醇）。 4 wk时剖杀动物，采用半定量RTPCR检测SCP2 mRNA在家兔肝组织的表达。 结果：对照组无结石形成；模型组成石率达87.5%. 与对照组相比，模型组动物肝组织SCP2 mRNA表达升高（0.79±0.17 vs 0.44±0.07，P<0.05）。 结论：高胆固醇膳食致家兔胆囊结石形成时肝组织SCP2 mRNA表达升高。

　　【关键词】 固醇携带蛋白2 成石指数 胆石模型

　　0.引言

　　胆囊胆固醇结石的发病机制尚不清楚。 目前认为肝脏胆固醇代谢紊乱，产生成石性胆汁，是胆囊胆固醇结石形成的首要和重要原因。 固醇携带蛋白2（sterol carrier protien2， SCP2）又称非特异性转脂蛋白（nonspecific lipid transfer protein，nsLTP）是一种Mr为13.0×103～14.8×103的可溶性碱性蛋白，存在于过氧化物酶体，线粒体，内质网和胞质中，肝脏中含量最高。 它一方面作为胆固醇和磷脂代谢的调节因子［1-2］，参与胆固醇的生物合成和胆固醇向胆汁酸、胆固醇酯及类固醇激素的转化；另一方面作为胆固醇转运器，参与细胞内、质膜间胆固醇的运输，并能将肝脏新合成的胆固醇直接从内质网快速转运至胆汁，因此在胆固醇结石形成中起显著作用［3］。 我们以往的研究发现，SCP2在胆囊胆固醇结石患者肝组织表达升高［4］。 为进一步研究SCP2表达与胆固醇结石形成的关系，我们采用高胆固醇膳食诱发家兔胆囊胆固醇结石模型，检测了家兔血清脂质成分、胆囊胆汁成分及成石指数（lithogenic index，LI）和肝组织SCP2 mRNA表达，以期阐明SCP2基因转录在胆固醇结石形成中的作用。

　　1.材料和方法

　　1.1材料健康北京大耳白家兔16只，体质量1.6～2.2 kg，3～4月龄，雌雄不拘，由天津市实验动物中心提供。 胆固醇干粉系天津市光复精细化工研究所产品，由天津市实验动物中心加工成与普通颗粒饲料外观相同的含12 g/kg胆固醇的颗粒饲料。 血脂测定试剂盒和胆汁胆固醇测定试剂盒购自北京中生北控生物科技股份有限公司。 胆汁酸测定试剂盒购自宁波市慈城生化试剂厂。 磷脂测定试剂盒购自北京利德曼生化技术有限公司。 胆汁LI通过Carey表计算［5］。 总RNA提取试剂盒购自美国Promega公司。 RTPCR试剂盒购自宝生物工程有限公司。 引物由上海生工生物工程有限公司合成。

　　1.2方法

　　1.2.1动物分组家兔适应性喂养1 wk后，随机分为2组，每组8只：对照组喂普通颗粒饲料；模型组喂含12 g/kg胆固醇的颗粒饲料。 动物自由进食饮水，分笼饲养4 wk. 剖杀前禁食水12 h，200 g/L乌拉坦（1 g/kg）耳缘静脉注入麻醉，碘伏消毒后开腹，迅速取肝组织置-80℃保存；取血5 mL；距胆囊 0.5 cm处结扎胆囊管并切断，完整分离胆囊，连同胆囊内胆汁一起置室温备用。［医学教　育网 搜集整理］

　　1.2.2RNA提取和RTPCR肝组织总RNA提取参见试剂盒说明。 家兔SCP2上游引物： 5′GCCAACGAACTCCTCACTTAT3′，下游引物： 5′TTGCCATTCTTCACATCTACCA3′，扩增片段517 bp；内参选用βactin：上游引物 5′GCC ATG TAC GTA GCC ATC CA 3′，下游引物 5′GAA CCG CTC ATT GCC GAT AG 3′，扩增产物长度为375 bp. 逆转录－扩增参数：50℃逆转录30 min，94℃，2 min终止反应。 94℃变性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸1 min，24个循环，循环后72℃延伸7 min. 5 μL PCR产物20 g/L琼脂糖电泳。 数字凝胶自动分析系统测定内参和目的基因扩增电泳带的光密度值。统计学处理：计量数据以x±s表示，两组间均数比较采用独立样本的t检验，率的比较采用Fisher确切概率法，采用SPSS 13.0统计软件进行分析。

　　2.结果

　　2.1胆囊结石成石情况两组动物生长良好。 对照组动物肝脏有光泽，质软，胆囊外观正常。 模型组动物脂肪肝表现：肝脏色泽变黄、变白，质地变硬；胆囊胀大，张力增高。 剖开胆囊，肉眼观察胆汁内棕黑色、成型颗粒，米粒大小；20倍光镜下见致密大团块胆固醇结晶判定为有结石，胆囊胆汁内未见有形成分判定为无结石。 对照组无结石形成；模型组8只动物高胆固醇膳食4 wk后有7只形成结石，成石率达87.5%，两组成石率差异有统计学意义（P<0.05）。

　　2.2血脂变化与对照组相比，模型组动物血清TG，CHO，HDLc和LDLc均有不同程度的升高，其中CHO，HDLc和LDLc的组间差异有统计学意义（表1）。 将血脂逐项引入相关分析，仅发现HDLc与成石指数LI呈负相关（Pearson相关系数r=-0.501，P=0.015）。 将两组动物血清CHO的构成作了比较，发现对照组血清CHO以HDLc为主（69.2%），而模型组CHO中HDLc 仅31.6%.

　　2.3胆囊胆汁成分测定结果和LI模型组动物胆囊胆汁胆固醇含量升高，胆汁酸含量降低，分别与对照组相比，差异有显著性意义（P<0.01，表2）。 模型组LI较对照组升高（P<0.05，表2）。表1胆结石兔血血脂变化表2胆结石兔胆囊胆汁成分和LI

　　2.4肝组织SCP2 mRNA的检测模型组SCP2 mRNA表达较对照组升高（0.79±0.17比0.44±0.07，P<0.05）有显著性意义。

　　3.讨论

　　高胆固醇膳食致兔胆囊结石时脂代谢变化的特点之一是胆固醇在血液中大量堆积。 我们发现模型组动物血清TC，HDLc和LDLc较对照组均升高，对照组HDLc占TC的69.2%，LDLc占TC的6.6%；而模型组动物HDLc虽较对照组升高，但仅占TC的31.6%，LDLc却占TC的42.2%. 由此可见模型组家兔血中胆固醇的堆积的同时，还存在构成比异常，主要表现为LDLc的升高，而HDLc的含量相对减少，使得HDL逆向转运胆固醇的作用大大减弱。

　　我们发现HDLc与LI之间存在负相关，提示高水平的HDLc可阻止胆石的发生，这可能也与肝脏清除超负荷的胆固醇时优先利用HDLc合成胆汁酸提高了胆汁中胆汁酸的含量有关，但由于高胆固醇膳食时胆固醇直接和间接排泌入胆汁的数量远远超过胆汁酸，最终还是导致胆汁胆固醇过饱和，结石形成。

　　体内胆固醇主要通过合成胆汁酸和直接分泌胆固醇入胆汁再排出体外，当胆固醇向胆汁酸合成的排除途径减弱后，则可能也只有通过排出更多的胆固醇入胆汁的形式排出体外，这必然造成胆汁中胆固醇过饱和、析出乃至结石形成。 在胆汁中胆固醇溶解于由胆汁酸、磷脂所构成的微团（micelle）中，LI是指在一定的微团中实际溶解的胆固醇量与在同一体系中所能溶解的胆固醇最大量的比值，正常胆汁LI小于1，胆固醇患者胆汁LI大于1. 模型组LI较对照组升高，提示高胆固醇膳食诱发胆囊结石形成时可通过上调SCP2 mRNA表达、增加胆固醇向胆汁的排泌和减少胆汁酸的生成两条途径来提高胆汁LI，促进胆囊结石的形成。

　　【参考文献】

　　［1］ Edqvist J， Blomqvist K. Fusion and fission， the evolution of sterol carrier protein2［J］。 J Mol Evol，2006， 62（3）： 292-306.

　　［2］ Milis DG， Moore MK， Atshaves BP， et al. Sterol carrier protein2 expression alters sphingolipid metabolism in transfected mouse Lcell fibroblasts［J］。 Mol Cell Biochem， 2006， 283（12）： 57-66.

　　［3］ Zanlungo S， Rigotti A， Nervi F. Hepatic cholesterol transport from plasma into bile： Implications for gallstone disease［J］。Curr Opin Lipidol， 2004， 5（3）： 279-286.

　　［4］ Cui NQ， Zhang SK， Cui YF， et al. Overexpression of sterol carrier protein2 mRNA in patients with cholesterol gallstones［J］。 Hepatobil Pancreat Dis Int， 2005， 4（1）： 117-120.

　　［5］ Carey MC. Critical tables for calculating the cholesterol saturation of native bile［J］。 J Lipid Res， 1978， 19（8）： 945-955。