【摘要】目的：研究脊髓背角胶质层神经元在超极化脉冲刺激下的细胞膜反应性，揭示神经元在超极化状态下膜的基本性质。 方法：在大鼠脊髓新鲜薄组织片上，利用脊髓薄片膜片钳全细胞记录技术，记录脊髓背角胶质层神经元接受超极化刺激后膜电位的变化情况。 结果：在电流钳模式下，膜电位在超极化刺激结束后，从超极化电位水平恢复到静息水平的过程中出现一个长时程的对抗回到静息水平的现象超极化反跳，该超极化反跳幅值的最大值为（16.5±3.8） mV；在电压钳模式下，同时可以记录到一个对应的长时程超极化激活的外向流，该外向流的最大幅值为：（45.0±2.1） pA，时程为：（475.0±0.8） ms. 该超极化反跳和超极化激活的外向流具有电压依赖性，没有时间依赖性。 结论：超极化刺激能引起大鼠脊髓胶质层神经元出现“超极化反跳”，该现象是神经元在超极化状态下的基本膜特性之一。

　　【关键词】 反跳 脊髓 胶质层 超极化 膜片钳

　　0.引言

　　接受去极化刺激后能够产生动作电位一直是判断细胞具有兴奋性的唯一标准。 然而大量的实验发现，神经元在接受超极化刺激后也能爆发动作电位。 “去极化反跳”现象对于神经元的放电模式、节律活动和突触可塑性具有重要的调节作用 ［1-2］。 该现象作为神经元的基本膜特性已在许多不同脑区的神经元上记录到，包括丘脑、小脑、海马和脊髓前角运动神经元 ［3-4］。 说明神经元在超极化状态下还隐藏着一些尚未发现的性质。 脊髓背角是接受来自伤害性感受器感觉纤维信息输入的第一级中继站。 胶质层神经元整合非伤害性和伤害性信息输入，在感觉信息加工和转换的可塑性中发挥着极其重要的作用［5］。 我们选择脊髓背角作为研究对象，以探索神经元在超极化状态下的细胞膜特性。

　　1.材料和方法

　　1.1材料两周龄新生SD大鼠，体质量26～30 g，雌雄不限（第四军医大学实验动物中心）。 戊巴比妥钠，NaCl，KCl，KH2PO4，MgSO4，CaCl2，NaHCO3，Glucose和Potassium gluconate （天津市医药公司产品）；记录电极（南京泉水实验器材厂）；恒流泵（HL2型，上海沪西仪器厂）；振动切片机（vibratome 1000 plus，美国Vibratome 公司）；显微镜（BX51WI，日本Olympus公司）；放大器（Multiclamp 700B，美国Axon公司）；模数转换器（Digidata 1322A，美国Axon公司）；渗透压仪（Model 501，美国Precision system 公司）。

　　1.2方法

　　1.2.1脊髓薄片标本制作手术开始前准备混合气饱和的冰浴人工脑脊液，用预先制备的琼脂切出一个表面有条浅沟的琼脂块，将分装的明胶置于40℃的恒温条件下备用。 戊巴比妥钠（30～40 mg/kg）麻醉动物，以角膜反射为指标，观察动物的麻醉程度。 待动物麻醉后，将其俯卧置于冰板上。 沿脊柱中线切开皮肤，分离结缔组织与肌肉。 从胸段至腰骶段行椎板切除术，暴露的脊髓立即用混合气饱和的冰浴人工脑脊液覆盖。 快速取出胸腰骶段脊髓，约2 cm长，移入冰浴人工脑脊液中，然后处死动物。 解剖显微镜下剥去软脊膜，除一侧的L4背根保留外，其余的背根与腹根尽皆剪除。 将带背根的脊髓置于琼脂块的浅槽内，将预热的明胶滴在脊髓块的胸腰段上对标本进行半包埋。 将琼脂块黏在切片机的载物台上，在预先冰浴的人工脑脊液中进行切片。 首先背根保持自然下垂，在手术显微镜下调整刀片的位置，在靠近背根进入处切片，移去上段。 再用小毛笔将背根刷向上，刀片下降250～300 μm再次切片，即可得到带背根的脊髓薄片。 将得到的脊髓标本移入混合气饱和的人工脑脊液中，24～26℃下孵浴最少1 h，然后开始记录。

　　1.2.2红外线可视全细胞记录实验用Olympus正置显微镜配有5×物镜（数字孔径为0.10），40×浸水物镜（数字孔径为0.80），IR～DIC透镜。 将脊髓切片移至记录用灌流槽内，用黏有平行细尼龙丝的U形铂丝固定。 在记录过程中，灌流速度保持在2～3 mL/min，温度24～26℃。 灌流槽置于显微镜载物台上，用5×物镜观察脊髓切片的分层，40×观察细胞进行可视封接。 本实验中，一般记录距离切片表面80～100 μm深度的脊髓背角神经元。 红外线可视条件下，状态良好的神经元表面光滑、立体感强，以此为标准选择要进行封接的细胞。 封接用微电极由薄壁有芯软质玻璃毛坯二次拉制而成，充灌电极内液后电阻为8～12 MΩ。 用微操纵仪操纵记录电极尖端接近所选神经元。 在电极接近细胞的过程中，用1 mL注射器从后部给微电极内施加正压，以防止电极尖端在脊髓组织内被堵塞。 微电极接触细胞时，会观察到细胞表面出现一个小凹，同时从封接测试窗口上显示封接电阻变大。 撤去正压，并施以一定的负压吸引，同时将钳制电压调至-60 mV，如果封接电阻上升至GΩ水平，一般为2～8 GΩ，说明封接成功。 等待约1 min，从微电极尾端给予短促的负压吸引，直至细胞膜被吸破，从而形成全细胞（wholecell）模式。

　　1.2.3数据采集与分析记录的信号经膜片钳放大器放大与4 kHz的滤波，由数据采样板进行A/D转换，采样频率为10～20 kHz， 存贮在计算机内。 分别在电压钳和电流钳模式下输入超极化方波刺激，记录神经元膜电位的反应情况和刺激诱导出来的电流。 所得数据以表示。［医学教 育网 搜集整理］

　　2.结果

　　2.1细胞超极化电流刺激记录电压反应当细胞接受增幅为-10 pA超极化电流刺激后，在膜电位向静息水平的复极过程中，再次出现明显的超极化以对抗膜电位回复到静息膜电位。 参考去极化反跳的定义［1］，我们把这个现象称为“超极化反跳”，随着刺激强度的增加，超极化反跳的幅值也在增大（图1）。 幅值的测量为膜电位超极化的最大值与静息膜电位之间的差值。 能引起超极化反跳的激活电流范围为：-40～-70 pA. 大于-70 pA的刺激不会引起超极化反跳的幅值进一步增大。 超极化反跳幅值的最大值为（16.5±3.8） mV。

　　2.2细胞超极化电压刺激记录电流反应在同一神经元上，增幅为-10 mV超极化电压刺激能引起快激活、慢失活的外向流，该外向流具有电压依赖性（图2A）。 激活电压范围为：-60～-110 mV. 电流的最大值为（45±2.1）pA （n=17），时程为（475±0.8）ms （n=17）。 图2B显示的是该外向流的IV曲线，从曲线可以看出该外向流幅度随膜电位的超级化而增大，其翻转电位为-100.8 mV. 图2C是该外向流的激活曲线，半数激活电压为-102 mV.

　　2.3超极化反跳和超极化激活外向流的时间依赖性分别在电压钳和电流钳模式下，固定输入的电流和电压刺激强度不变，而改变刺激的时间，分别以25 ms和5 ms的量递增，发现超极化反跳和外向流的幅值均没有发生变化（图3）。 说明记录到的超极化反跳和外向流不具有时间依赖性。

　　3.讨论

　　以往认为神经元在静息状态时，只会对引起膜电位去极化的刺激产生反应，而没有注意到对于引起膜电位超极化刺激神经元会有何反应，忽略了神经元处于比静息膜电位更超极化状态下的反应性。 在本实验中，脊髓背角神经元在接受超极化刺激后，当膜电位处于-110 mV甚至更负的状态下，神经元在复极过程中出现了再次超极化的现象。 这提示神经元在接受引起膜电位超极化的刺激后会对刺激发生反应，而且反应具有多样性，包括产生去极化反跳，爆发动作电位和“超极化反跳”，发生再次超极化。 这两个现象具有对应性：两者的激活条件相同，出现的时间点相同，而且都具有电压依赖性。 但是反跳和超极化反跳之间也存在许多不同点：表现方向截然相反。 反跳是膜电位去极化，而超极化反跳是膜电位超极化；反跳在神经系统的不同区域均被记录到，有关超极化反跳在此之前的研究报道较少，并且该现象在本实验中的发生率也很低，不到10％。

　　我们参考“去极化反跳”的定义，结合实验中记录到该现象的特点给出了“超极化反跳”的定义。 Burdakov等［6］定义的超极化反跳是指细胞膜在接受超极化刺激后，膜电位的复极时程较长，并没有出现本研究所记录的复极过程中出现的二次超极化现象。 在本研究中，超极化反跳在大鼠脊髓背角胶质层神经元上表现为接受超极化刺激后，膜电位在复极前长时程的超极化现象，而且记录到了一个对应的外向电流。 因此，我们认为用“超极化反跳”来定义这个现象更确切。 对胶质层神经元超极化状态下细胞反应特性的研究能揭示感觉神经元功能的复杂性，为进一步探索感觉信息传递机制提供实验及理论依据。

　　【参考文献】

　　［1］ Surges R， Sarvari M， Staffens M， et al. Characterization of rebound depolarization in hippocampal neurons ［J］。 Biochem Biophys Res Commun， 2006， 348（4）：1343-1349.

　　［2］ Bertrand S， Cazalets JR. Postinhibitory rebound during locomotorlike activity in neonatal rat motoneurons in vitro ［J］。 J Neurophysiol， 1998， 79（1）：342-351.

　　［3］ Aizenman CD， Linden DJ. Regulation of the rebound depolarization and spontaneous firing patterns of deep nuclear neurons in slices of rat cerebellum ［J］。 J Neurophysiol， 1999， 82（4）：1697-1709.

　　［4］ Chen K， Aradi I， Thon N. Persistently modified hchannels after complex febrile seizures convert the seizureinduced enhancement of inhibition to hyperexcitability ［J］。 Nat Med， 2001， 7（3）：331-337.

　　［5］ Pan YZ， Pan HL. Primary afferent stimulation differentially potentiates excitatory and inhibitory inputs to spinal lamina II outer and inner neurons ［J］。 J Neurophysiol， 2004， 91（6）：2413-2421.

　　［6］ Burdakov D， Ashcroft FM. Cholecystokinin tunes firing of an electrically distinct subset of arcuate nucleus neurons by activating AType potassium channels ［J］。 J Neurosci， 2002， 22（15）：6380-6387.