【摘要】  研究慢性束缚应激大鼠（肝郁脾虚模型）的血浆代谢表型改变，开展中医证候学的研究，试图通过对慢性束缚应激大鼠代谢物组的共性分析和生物标记物的发现，寻找肝郁脾虚证候的生物学本质，探讨代谢组学在中医证候学研究中的应用。方法：选用实验用二级雄性SD大鼠24只，随机分为4组：7 d正常对照组（A组）、21 d正常对照组（B组）、 7 d 模型组（C组）和21 d模型组（D组），每组6只。以慢性束缚方法制作应激大鼠模型。分别于第8天和第22天麻醉后心室取血，用Varian UnityInova 600 M超导傅立叶变化核磁共振（nuclear magnetic resonance， NMR）波谱仪检测。自由感应衰减信号经过32 k傅立叶变换转为一维NMR谱图。调用VNMR软件中的程序将1H谱按默认值，分别从4.5～0.5 ppm（弛豫时间编辑）以及6.0～0 ppm（扩散编辑），每段为 0.04 ppm ，进行分段积分，将积分数据归一化后，以文本文件或Excel文件贮存，用于模式识别分析。将上述得到的数据文件利用Simca-P 10.0软件包进行主成分分析。结果：大鼠血浆 1H NMR谱的主成分分析，各组动物代谢谱各不相同，与已知应激状态下动物体内代谢的调节过程及结果相一致。正常对照组与模型组相比较发现，醋酸、乳酸、酪氨酸、低密度脂蛋白和3.44 ppm的未知化合物的谱峰峰形改变较为明显。这些发生改变的代谢物可以作为肝郁脾虚证的生物标志物做进一步的研究。结论：各组大鼠血浆 1H NMR代谢谱之间存在差异，而且可能从代谢组学分析中找出特异的标志性代谢产物，阐释中医证候的生物学本质。代谢组学分析是一种有良好发展前景的中医证候学研究方法。

　　【关键词】  代谢组学

　　代谢组学是继基因组学、转录组学和蛋白质组学之后新近发展起来的一门学科，是系统生物学的重要组成部分。它主要研究生物对外源性物质所引起的病理生理反应，以及对遗传变异的应答和内源性代谢物的动态变化，通过对生物体液和组织中随时间改变的代谢物进行检测、确定、定量和分类，将这些代谢信息与病理生理过程中的生物学事件关联起来，以监测活细胞中的化学变化。本课题组用慢性束缚应激大鼠模型，以动物行为学评定和以方测证等方法确定该模型为肝郁脾虚证候模型，运用代谢组学技术开展中医证候学的研究，试图通过对中医病证引起的代谢物的共性分析和生物标记物的发现，寻找中医证候的生物学本质，促进中医辨证的科学化和定量化，将代谢组学技术和中医药学的研究结合起来，探索出中医药复杂理论体系研究的新方法与新途径。

　　1 材料与方法

　　1.1 动物与分组 实验用二级雄性SD大鼠 24只 ，体质量（200±20）g，购自北京维通利华实验动物研究中心，合格证号为SCXK-京2002-0003.适应性饲养3 d后随机分为：7 d正常对照组（A组）、21 d正常对照组（B组）、7 d模型组（C组）和21 d模型组（D组）4组，每组各6只。动物每笼6只群养，饲养于普通级动物房，室内温度保持为（22±2）℃，相对湿度保持为30%～40%，各组大鼠喂常规饲料，自由进食饮水。

　　1.2 造模方法 以慢性束缚方法制作大鼠肝郁脾虚证模型，将大鼠束缚于特制的束缚架上（T型束缚台：底座宽10 cm、长20 cm、厚2.8 cm，上端束缚台长22 cm，最宽处6.6 cm，前端有固定头部的小架和适合四肢放置的凹槽，上端束缚台有3条可调的软 带，两宽一窄，分别在头颈部、胸腰和腰背固定）， 3 h/d ，C组连续7 d，D组连续21 d，随机选取束缚时间点。整个束缚过程中动物在同一环境中，不予以进水和食物。正常对照组均散养于各自的饲养箱中3 h.

　　1.3 取材与处理［1，2］ 分别于第8天和第22天清晨8时，用2%戊巴比妥钠40 mg/kg腹腔注射进行深度麻醉，手术剪剖开胸腔，用注射器穿刺左心室取血浆，采集血浆后于-20 ℃冰箱中保存备用。核磁共振（nuclear magnetic resonance， NMR）测量前样品准备：取出血浆，常温解冻，用德国Ep-pendorf公司产5424型离心机离心（14 000 r/min， 10 min），取上清300 μl，添加0.1% 2，2，3，3，三甲基甲硅烷基丙酸｛3-（trimethylsiyl）［2，2，3，3-2H4］propionate， TSP｝重水溶液100 μl、200 μl D2O于 5 mm 样品管中，混匀，于4 ℃冰箱保存，备用。

　　1.4 NMR数据采集 在军事医学科学院生物医学分析中心核磁共振实验室进行检测，27 ℃条件下，在Varian UnityInova 600 M 超导傅立叶变化核磁共振波谱仪上调用弛豫时间编辑（Carr-Purcell-Meiboom-Gill， CPMG）和扩散编辑（longitudinal eddy-delay， LED）相关脉冲序列，采用预饱和方式抑制水峰，饱和时间为2 s，混合时间为0.15 s，谱宽8 000 Hz，采样点数32 k，累加次数64次，预饱和频率和中心频率都在水峰位置。自由感应衰减（free induction decay， FID）信号经过32 k傅立叶变换转为一维NMR谱图。以TSP为化学位移参考峰的位置，设为0 ppm.调用VNMR软件中的程序将1H 谱按默认值，分别从4.5～0.5 ppm（CPMG）以及6.0～0 ppm（LED），每段为0.04 ppm，进行分段积分。将积分数据归一化之后，以文本文件或Excel文件贮存，用于模式识别分析。

　　1.5 主成分分析 将积分值进行中心化和比例换算，用SIMCA-P 10.0软件包（瑞典， Umetrics AB， Umea）进行主成分分析（principal component analysis ， PCA），求出主成分（principal compo-nents， PC），利用PC对各组大鼠血清的代谢组分进行分析，必要时进行判别分析（partial least squares discriminate analysis， PLS-DS）。

　　2 结果

　　2.1 四组动物血清1H NMR图谱 见图1.

　　图1 四组动物血清的典型1H NMR谱图（略）

　　Figure 1 Serum spectra of 600-M Hz1H NMR in 4 groups

　　A： Group A （7 d normal control group）； B： Group B （21 d normal control group）； C： Group C （7 d stress group）； D： Group D （21 d stress group）。

　　2.2 时点相同的正常对照组与模型组动物血清1H NMR谱模式识别分析 A、C两组动物血清LED实验1H NMR谱的波峰积分值的PCA结果见图2.LED实验表明：A、C两组大致以t5轴分开，A组样本中极低密度脂蛋白（very low density lipoprotein， VLDL）和低密度脂蛋白（low density lipoprotein， LDL）（0.87、0.91、0.95和0.99）、高密度脂蛋白（high density lipoprotein， HDL）（0.83）、胆碱（ 3.23 和3.27）、N-乙酰糖蛋白（N-acetyl-glycopro-tein， NAC）NAC1（2.07）等化合物含量较高； C组长链脂肪酸（1.31、1.23、1.27、1.36和1.39）、NAC2（ 2.15 ）以及1.59 ppm处未知化合物含量较高。

　　B、D两组动物血清LED实验1H NMR谱的波峰积分值的PCA结果见图3.B、D两组样本间沿t4轴方向基本分开。从因子载荷图上看，B组样本中LDL（0.87、0.91和1.27）以及化学位移在4～5左右的含氧脂肪酸、不饱和脂肪酸等化合物的含量较高；D组样本中LDL含量不高，NAC1（2.07）、 NAC2（2.16）及化学位移在1～3之间的饱和脂肪酸含量较高。A、C两组动物血清CPMG实验1H NMR谱的波峰积分值的PLS-DA结果见图4.CPMG实验结果表明，A组和C组组内样本间个体差异较大，且点c5与其他点有明显差异。在排除点c5的基础上进行PLS-DS.从得分图中可以看出，A、C两组可被图中所示虚线大致分开。从因子载荷图中可以看出，A组样本中乳酸（1.36、1.38、1.4、4.16和 4.12 ）、丙氨酸（1.44）、脂类化合物（0.92和1.36）、血糖（3～4）、NAC2（2.16）以及谷氨酸（2.4）含量较高；而C组样本中NAC1（2.08）、小分子化合物（ 1.12 ）以及乙醇和1.2 ppm与3.4 ppm所代表的未知化合物含量较高。B和D组进行的CPMG实验，PLS-DS和PCA两组都未能分开。

　　2.3 不同时点的正常对照组组间和模型组组间的动物血清1H NMR谱模式识别分析 A、B两组动物血清LED实验1H NMR谱的波峰积分值的PCA结果见图5.LED实验表明：A、B两组被图中所示虚线较好地分开。因子载荷图结合原始图谱分析，A组样本中VLDL和LDL（0.87、0.91、1.27、1.31和1.35）、胆碱（3.23、3.27）以及不饱和脂肪酸（ 1.99 、5.31和5.35）等化合物含量较高；B组仅化学位移在3～4之间的可能为含氧脂肪酸的化合物含量较高。C、D两组动物血清LED实验1H NMR谱的波峰积分值的PCA结果见图6.C、D两组分组趋势明显，但是点c6与本组其他样本间有明显不同。排除c6后仍进行PCA分析，得分图中可看出，C、D两组沿t1轴能较好地分开，因而t1轴方向表示组间差异；各组内样本沿t2轴方向散开，因而t2轴方向表示组内差异。因子载荷图结合原始谱图分析，C组样本中VLDL和LDL（0.87、0.91、1.27、1.31和1.35）、胆碱（3.23、3.27）以及不饱和脂肪酸（5.31、5.35）等化合物含量较高；而D组中仅化学位移在 3～4 之间的可能为含氧脂肪酸的化合物和NAC含量较高。A、B两组动物血清CPMG实验1H NMR谱的波峰积分值的PCA结果见图7.CPMG实验表明，A、B两组样本可被如图所示虚线大致分开。从因子载荷图中可以看出，A组样本中乳酸（1.36）、苏氨酸（1.32）、脂类化合物（0.92、0.96）、丙氨酸（1.52）、NAC1（2.08）、3-羟基丁酯（1.28）以及2～3之间的小分子化合物含量较高；而B组样本中血糖（3～4）、谷氨酸（2.44）、醋酸（1.96）及1.48 ppm和 1.24 ppm 处所表示的未知化合物含量较高。

　　C、D两组动物血清CPMG实验1H NMR谱的波峰积分值的PCA结果见图8.C、D两组样本沿t2轴显示出一定的分组趋势，但两组内样本间差异太大，而且c5和d1两样本与其他样本间有明显不同。排除c5和d1后对剩余数据进行PCA分析，从得分图中可看出，两组样本被图中所示虚线分开。从因子载荷图中可看出，C组样本中脂类化合物（ 0.96 、0.89、0.92、1.32和1.36）、血糖（3～4）、NAC1（2.08）、NAC2（2.2），以及1.24 ppm和 3.4 ppm 处所表示的化合物含量较高；D组样本中乳酸（1.4、 4.16 ）、醋酸（1.96）、胆碱（3.24）、 1.48 ppm 等处化合物含量较高。

　　2.4 对1H NMR图谱及模式识别的进一步分析 各正常对照组图中主成分积分值基本集中分布于椭圆形散点图（95%置信区内）的4个区域，各正常对照组间无明显交叉和重叠。对其进一步分析发现，与正常对照组相比，C、D两组中醋酸（1.99、4.12、4.16）及3.44 ppm的未知化合物的谱峰相对积分面积明显增高而乳酸（1.34）、酪氨酸（6.95、7.27）和LDL（0.87、0.9、0.95和0.99）的谱峰相对积分面积明显下降。见图1、2、3和4.

　　图2 A、C两组血清代谢组PCA分值（t［4］ vs t［5］）散点分布和因子载荷（p［4］ vs p［5］）图（扩散编辑）（略）

　　Figure 2 PCA score （t［4］ vs t［5］） and loading （p［4］ vs p［5］） plots for groups A and C serum spectra （LED）

　　A： Group A （7 d normal control group）； C： Group C （7 d stress group）。

　　图3 B、D两组血清代谢组PCA分值（t［3］ vs t［4］）散点分布和因子载荷（p［3］ vs p［4］）图（扩散编辑）（略）

　　Figure 3 PCA score （t［3］ vs t［4］） and loading （p［3］ vs p［4］） plots for groups B and D serum spectra （LED）

　　B： Group B （21 d normal control group）； D： Group D （21 d stress group）。

　　图4 A、C两组血清代谢组PLS-DS分值（t［1］ vs t［2］）散点分布和因子载荷（w*c［1］ vs w*c［2］）图（弛豫编辑）（略）

　　Figure 4 PCA score （t［1］ vs t［2］） and loading （w*c［1］ vs w*c［2］） plots for groups A and C serum spectra （CPMG）

　　A： Group A （7 d normal control group）； C： Group C （7 d stress group）。

　　图5 A、B两组血清代谢组PCA分值（t［1］ vs t［2］）散点分布和因子载荷（p［1］ vs p［2］）图（扩散编辑）（略）

　　Figure 5 PCA score （t［1］ vs t［2］） and loading （p［1］ vs p［2］） plots for groups A and B serum spectra （LED）

　　A： Group A （7 d normal control group）； B： Group B （21 d normal control group）。

　　图6 C、D两组血清代谢组PCA分值（t［1］ vs t［2］）散点分布和因子载荷（p［1］ vs p［2］）图（扩散编辑）（略）

　　Figure 6 PCA score （t［1］ vs t［2］） and loading （p［1］ vs p［2］） plots for groups C and D serum spectra （LED）

　　C： Group C （7 d stress group）； D： Group D （21 d stress group）。

　　图7 A、B两组血清代谢组PCA分值（t［2］ vs t［3］）散点分布和因子载荷（p［2］ vs p［3］）图（弛豫编辑）（略）

　　Figure 7 PCA score （t［2］ vs t［3］） and loading （p［2］ vs p［3］） plots for groups A and B serum spectra （CPMG）

　　A： Group A （7 d normal control group）； B： Group B （21 d normal control group）。

　　图8 C、D两组血清代谢组PCA分值（t［1］ vs t［2］）散点分布和因子载荷（p［1］ vs p［2］）图（弛豫编辑）（略）

　　Figure 8 PCA score （t［1］ vs t［2］） and loading （p［1］ vs p［2］） plots for groups C and D serum spectra （CPMG）

　　C： Group C （7 d stress group）； D： Group D （21 d stress group）。

　　3 讨论

　　本课题组在以往的研究中发现，慢性束缚应激状态下，中枢内源性阿片肽及相关指标在海马、皮层和边缘系统出现异常变化，中药三个复方（疏肝、健脾和补肾）对其变化均有不同程度的调整作用，而疏肝中药对皮层和海马的调节作用优于其他两种复方，并显示出多靶点和双向调节作用。作用途径其一是对模型大鼠行为学异常变化有恢复作用，其二是增强模型大鼠免疫功能，其三是增加模型大鼠下丘脑单胺递质等含量，增加模型大鼠海马单胺递质含量与海马脑啡肽与前强啡肽mRNA表达，增加模型大鼠中枢糖皮质激素受体及相关mRNA表达，增加模型大鼠中枢神经营养因子的含量。研究发现，逍遥散对慢性应激状态下中枢内源性阿片肽有调节作用，调节位点位于下丘脑、边缘系统和皮层，提出肝主疏泄在应激调节中起主导作用，从肝论治应激导致的气血紊乱与补脾和补肾同等重要，肝主疏泄与应激的调节位点除下丘脑-垂体-肾上腺皮质以外，还有海马和皮层等边缘系统；提出神经营养因子和内源性阿片肽通过对海马的保护作用来影响下丘脑-垂体-靶腺轴，从而实现对机体免疫功能的调节，验证慢性束缚应激大鼠为肝郁脾虚证模型。在此基础上系统地提出了肝主疏泄的现代生理学内涵以及肝郁脾虚证的病理生理基础［3～8］。本实验运用代谢组学技术，从1H NMR图谱及模式识别分析发现：（1）各正常对照组图中主成分积分值基本集中分布于椭圆形散点图（95%置信区内）的4个区域，各正常对照组间无明显交叉和重叠。表明正常组与模型组之间存在代谢产物谱的显著差异。也就是说正常组与以慢性束缚方法制作的应激大鼠肝郁脾虚证模型组之间有着代谢产物的不同，说明血浆代谢组学分析能够较好地反映证候之间的差异，代谢组学技术是开展中医证候研究的好方法。（2）在1H NMR图谱中可以发现醋酸、乳酸、酪氨酸、LDL和3.44 ppm的未知化合物的谱峰峰形改变较为明显。这些发生改变的代谢物可以作为肝郁脾虚证的生物标志物做进一步的研究。（3）醋酸、乳酸、LDL、酪氨酸与三羧酸循环能量代谢、糖酵解及脂肪和蛋白质代谢途径密切相关，上述内源性代谢物的改变提示动物能量代谢及脂肪、蛋白质代谢功 能异常，这与已知的应激状态动物体内代谢的调节过程及结果相一致。分析这些内源性代谢产物的形成、转移机制和过程，可提示肝郁脾虚证的发生发展的潜在原因，从而揭示其生物学本质。中医证候之间可能存在着非常明显的代谢产物的不同，这种不同是基于不同证候存在着不同物质代谢或其代谢网路的改变。中医证候的生物学基础可能用代谢组学技术来找出特异的标志性代谢产物，用生物信息学方法分析生物标志物的功能，并确定“中医证候相关代谢谱”。

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