【关键词】  分枝杆菌，结核；Rv2389；基因表达

　　Construction and expression of eukaryotic  expression vector of Mycobacterium tuberculosis Rv2389

　　XUE Ying，  BAI YinLan， GAO Hui， WANG LiMei， XU ZhiKai

　　Department of Microbiology， School of Basic Medicine， Fourth Military Medical University， Xian 710033， China

　　【Abstract】AIM：  To construct the eukaryotic expression vector encoding Mycobacterium tuberculosis Rv2389 and express it in CHO cells. METHODS： The gene encoding Rv2389 protein were amplified by polymerase chain reaction（PCR）from genome of Mycobacterium tuberculosis H37Rv strain. After sequenced， Rv2389 gene segments were  subcloned into eukaryotic expression vector pCDNA3.1（-）。 The recombinant plasmid pCDNARv2389 were transfected into CHO cells with liposome. The expressions of mRNA and protein encoded by this gene were detected respectively with RTPCR  and  indirect immunofluoresent technology. RESULTS： Rv2389 was cloned into pCDNA3.1（-） correctly， and its expression at mRNA and protein levels was detected in CHO cells. CONCLUSION： Recombinant eukaryotic plasmid encoding Rv2389 was constructed successfully. The experiment established the basis for further study on the function of Rv2389.

　　【Keywords】 mycobacterium tuberculosis； Rv2389； gene expression

　　【摘要】目的：构建结核分枝杆菌Rv2389基因真核表达载体。 方法：PCR扩增Rv2389基因，测序正确后克隆入真核表达载体pCDNA3.1（-），重组质粒酶切鉴定正确后以阳离子聚合物转染CHO细胞后， 分别以RTPCR方法检测mRNA表达和间接免疫荧光技术检测目的蛋白的表达。 结果：构建了重组质粒pCDNA Rv2389， RTPCR结果证明Rv2389可在CHO细胞中转录，间接免疫荧光检测证明，表达有Rv2389蛋白的细胞着染。 结论：成功构建了结核分枝杆菌Rv2389基因的真核表达载体pCDNARv2389，Rv2389基因可以在CHO细胞中表达。

　　【关键词】 分枝杆菌，结核；Rv2389；基因表达

　　0引言

　　结核病是目前危害全球人类健康的重要传染病。 这主要是因为① 卡介苗（BCG）对成年人结核病的预防效果不稳定，保护力为0%~70%；② 没有特异性的诊断试剂；③ 艾滋病等免疫缺陷个体的出现加快了本病的严重后果；④ 耐药菌株的大量出现［1］。 因而寻找更有效的替代卡介苗的疫苗已成为当务之急。 Rv2389蛋白是结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis， MTB） 复活促进因子（resuscitationpromoting factor，  Rpf）样蛋白家族的一员，序列分析发现，它不仅与细菌的增殖有关，还有可能是宿主免疫系统识别的一个靶抗原［2］。 为此，我们在Rv2389原核表达和纯化的基础上，构建了真核表达载体并在CHO（ 中国仓鼠卵巢）细胞中进行表达，同时从其表达水平和基因转录两方面进行鉴定，为其功能研究奠定基础。

　　1材料和方法

　　1.1材料

　　MTB H37Rv菌株，P815细胞由本室保存；真核表达载体pCDNA3.1（-）由本室保存；含有Rv2389基因的重组质粒pPro EX HTRv2389由本室构建保存；Rv2389蛋白多抗由本实验室制备；AMV，RNA 酶抑制剂和TRIzol（Promega公司）；限制性内切酶、T4 DNA连接酶和核酸分子质量标准品（宝泰克公司）；质粒提取试剂盒（Omega公司）；梭华soft阳离子聚合物（厦门太阳马公司）；羊抗鼠荧光抗体（宝信公司）。

　　1.2方法

　　1.2.1Rv2389基因片段的扩增与测序结核分枝杆菌Rv2389全基因序列的特异性引物序列为：P1：5′gga tcc gcc acc atg acc ccg ggt ttg ctt ac3′，含BamHⅠ酶切位点，起始码和cozak序列；P2：5′ccg aag ctt atc gtc cct gct ccc cga tga3′，含HindⅢ酶切位点和终止码。 PCR反应条件：94℃ 40 s，56℃ 30 s，72℃ 1 min，共30个循环，72℃延伸10 min. 回收PCR产物，用T4连接酶将PCR产物与pGEMTeasy载体连接，转化E.coli DH5α，随机挑取5个克隆提取质粒进行双酶切鉴定，取2个鉴定正确的克隆进行测序［3］。

　　1.2.2重组质粒的构建及鉴定将测序正确的Rv2389基因克隆至真核表达载体pCDNA3.1（-），构建重组质粒pCDNARv2389. 连接转化、质粒提取均按文献进行［3］。 以BamHⅠ和HindⅢ酶切pCDNARv2389，10 g/L琼脂糖凝胶电泳鉴定重组质粒。

　　1.2.3细胞转染将5×105 个CHO细胞接种于6孔板，细胞数量达孔底约2/3时进行转染。 转染前用不含抗生素的1640培养液洗2次，以0.5 mL 1640培养液重悬细胞。 pCDNARv2389重组质粒10 μL和阳离子聚合物5 μL各用80 μL无血清的1640培养液稀释，两者混匀后室温作用20 min，缓慢加入到细胞中。  培养24 h后收集细胞，同时设正常细胞对照。

　　1.2.4RTPCR检测mRNA表达收集重组质粒转染的CHO细胞，2000 r/min离心10 min. 参照Gibco的TRIzol试剂盒说明书提取细胞mRNA. 在上述10 μL mRNA 溶液中，加入1 μL Oligo（dT）12-18引物，70℃水浴5 min后立即置于冰上，加10×buffer 4 μL， MgSO4 4 μL， 10 mmol/L dNTPs 2 μL，RNA inhibitor 0.6 μL，AMV 0.8 μL，H2O 10.4 μL. 混匀，42℃作用1 h，70℃ 15 min终止反应。 PCR反应时加入cDNA第1链2 μL，反应条件为94℃预变性5 min，94℃变性30 s，55℃复性30 s，72℃延伸40 s，共进行30个循环，末次循环72℃延伸2 min，扩增产物以10 g/L琼脂糖凝胶电泳检测。

　　1.2.5间接免疫荧光检测目的基因表达将转染pCDNARv2389质粒的CHO细胞爬片，用纯化的Rv2389融合蛋白制备的免疫血清作为一抗，间接免疫荧光法检测CHO细胞中融合蛋白的表达［4］。

　　2结果

　　2.1目的基因的扩增、克隆及酶切鉴定用PCR方法从H37Rv中扩增出Rv2389的DNA片段，被顺利克隆入pGEMTeasy载体，测序证实所克隆的基因完全正确。 序列分析与GenBank报道的一致（图1）。

　　M：DL2000 marker；1：PCR产物。

　　图1Rv2389基因的PCR结果（略）

　　2.2重组质粒的酶切鉴定重组质粒pCDNARv2389被BamHⅠ和HindIII 双酶切后可得到约475 bp的片段，与预期的大小相一致（图2）。

　　M：DL2000 marker；  1～3： pCDNARv2389被BamHⅠ和HindⅢ双酶切。

　　图2重组质粒的酶切鉴定（略）

　　2.3RTPCR检测mRNA表达在约475 bp处扩增出特异性基因（图3），表明pCDNARv2389重组质粒可以在CHO细胞中转录。

　　M：DL2000 marker；1：  RTPCR产物。

　　图3重组质粒转染CHO细胞的RTPCR结果（略）

　　2.4间接免疫荧光检测目的基因表达转染细胞在经过间接免疫荧光染色后，阳性细胞有较强的荧光着染，表达蛋白定位于细胞膜上，而对照组细胞没有着染（图4）。

　　A：Rv2389融合蛋白在CHO细胞内表达；B：对照。

　　图4间接免疫荧光测定融合蛋白在CHO细胞中的表达×400（略）

　　3讨论

　　Mukamolova GV等［5］研究发现藤黄微球菌（Micrococcus luteus， M. luteus）可分泌一种Rpf，该因子可刺激该菌休眠体复活和生长，也可促进繁殖体生长，研究证实Rpf作用与真核细胞的细胞因子相似，具有自我刺激作用又称细菌因子。 同时进一步研究证实该因子也可以刺激其他种类的高（G+C）%的革兰阳性菌，包括结核分枝杆菌。 结核分枝杆菌全基因序列分析表明，其中Rv1884c；Rv2450c，Rv0867c，Rv1009，Rv2389c和基因与M.luteus菌Rpf基因同源，其中4个基因编码的蛋白是分泌蛋白，推测结核杆菌这些基因编码的蛋白可能也具有Rpf作用，但尚无直接证据［5-6］。 Sassetti等［7］采用大规模插入突变分析发现Rpf样蛋白并不是H37Rv株生长所必需，而且这5种Rpf样蛋白在功能上有一定的重叠。 因为突变Rv1009基因可明显减缓MTB的生长速度，提示其在MTB的生长中可能发挥着较为重要的作用。 以往研究［8］表明，MTB H37Rv株的几种Rpf样蛋白与M.luteus的Rpf蛋白一样，都属于膜蛋白，因而这些蛋白（或者这些蛋白中的某个或某几个蛋白）有可能会被宿主的免疫系统所识别，从而有可能作为亚单位疫苗的备选组分。

　　近年来，国外在TB新型疫苗或增强BCG免疫效果方面已作了大量的研究工作，并正在进行大规模的候选疫苗筛选工作。 由于结核分枝杆菌Rpf家族蛋白不仅可以促进结核休眠菌复活，而且还具有多种生物学活性如自溶素和/或青霉素结合蛋白的功能、细胞学方面的功能等［9］，此外这几种Rpf样蛋白与M.luteus的Rpf蛋白一样，都属于膜蛋白，因而这些蛋白（或者这些蛋白中的某个或某几个蛋白）有可能会被宿主的免疫系统所识别，从而有可能作为亚单位疫苗的备选组分。 在本实验中，我们在Rv2389原核表达和纯化的工作基础上构建了真核表达载体并在CHO细胞中进行表达，同时从其表达水平和基因转录两方面进行鉴定，为其在新型疫苗的应用中奠定了基础。

　　【参考文献】

　　［1］ Kumar H， Malhotra D， Goswami S， et al. How far have we reached in tuberculosis vaccine development？［J］。Crit Rev Microbiol， 2003，29（4）：297-312.

　　［2］ Mukamolova GV， Kaprelyants AS， Young DI， et a. lA family of autocrine growth factors in Mycobacterium tuberculosis［J］。 Mol Microbiol， 2002，46（3）：623-635.

　　［3］ 高雪，薛莹，姜泓，等。 结核分枝杆菌furA基因片段的克隆、表达和分离纯化［J］。 第四军医大学学报， 2004， 25（18）：1637-1640.

　　［4］ 师长宏，范雄林，徐志凯，等。  融合表达Ag85BESAT6的结核分枝杆菌真核表达载体的构建及其免疫原性［J］。 第四军医大学学报， 2004，25（2）：121-124.

　　［5］ Mukamolova GV， Kaprelyants AS， Young DI， et al. A bacterial cytokine［J］。 Proc Natl Acad Sci USA， 1998， 95（15）：8916-8921.

　　［6］ Martin CG， Nicholas HK， Angharad PD， et al. Resuscitationpromoting factors possess a lysozymelike domain［J］。Trends Biochem Sci， 2004，29（1）：7-10.

　　［7］ Sassetti CM， Boyd DH， Rubin EJ. Genes required for mycobacterial growth defined by high density mutagenesis［J］。Mol Microbiol， 2003，48（1）：77-86.

　　［8］ Tjalsma H， Bolhuis A， Jongbloed JD， et al. Signal peptidedependent protein transport in Bacillus subtilis： A genomebased survey of the secretome［J］。 Microbiol Mol Biol Rev， 2000，64（3）： 515-547.

　　［9］ Smith TJ， Blackman SA， Foster SJ. Peptidoglycan hydrolases of Bacillus subtilis 168［J］。 Microb Drug Resist， 1996，2（1）：113-118.