【摘要】  研究日本新近研制的第三代3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A（3-hydroxy-3-methyl-glutaryl-CoA， HMG-CoA）还原酶抑制剂匹伐他汀（pitavastatin， NK-104）对人肝癌细胞凋亡及半胱氨酸蛋白酶3（caspase-3）活性的影响。方法：采用细胞培养技术，以肝癌细胞系HepG 2为靶细胞，以不同浓度的药物处理细胞48 h后，利用WST-8法测定NK-104对细胞增殖的影响；利用荧光染料Hoechst 33258染色，荧光显微镜观察细胞核碎片；以流式细胞仪分析细胞周期的变化；采用半胱氨酸蛋白酶3比色法检测caspase-3活性。结果：NK-104（10 μmol/L）对HepG 2细胞有明显抑制作用，可诱导HepG 2细胞凋亡，并能增强caspase-3基因的活性。结论：NK-104能够诱导HepG 2细胞凋亡，其机制与caspase-3依赖性凋亡调节信号通路有关。

　　【关键词】  肝癌

　　3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A（3-hydroxy-3-methyl-glutaryl-CoA， HMG-CoA）还原酶抑制剂，统称为抑制素，是重要的脂类合成抑制剂，主要在人体肝脏中代谢，临床上广泛应用于治疗高脂血症［1］。 最近研究发现，HMG-CoA还原酶抑制剂具有生物学多效性，与降血脂无关。有报道其在体外具有抗癌作用［2］、体内与5氟尿嘧啶（fluorouracil， 5-Fu）共同作用能够延长晚期肝癌患者的生存期［3］。匹伐他汀（pitavastatin， NK-104）是日本新近研制的第三代高效HMG-CoA还原酶抑制剂［4］。在血管内皮细胞系NK-104通过磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B（phosphoinositide 3-kinase/protein kinase B， PI3K-Akt）基因激活途径对内皮细胞的保护作用已有报道［5］，但其在肝癌细胞系的抗癌作用尚未见报道。本文在肝癌细胞系HepG 2通过2-（2-甲氧基-4-硝基苯）-3-（4-硝基苯）-5-（2，4-二硫代苯）-2H-四氮唑单钠盐 ｛［2-（2-methoxy-4-nitrophe-nyl）-3-（4-nitrophenyl）-5-（2，4-disulfophenyl）-2H-tetrazolium， monosodium salt］， WST-8｝、荧光染料Hoechst33258染色、流式细胞仪和半胱氨酸蛋白酶3比色法等检测方法，研究NK-104对人肝癌细胞凋亡及半胱氨酸蛋白酶3（caspase-3）活性的影响，为NK-104在抗肿瘤中的作用机制提供实验依据。

　　1 材料和方法

　　1.1 主要材料与仪器 NK-104，日本兴和有限公司（日本名古屋）和日产化学工业公司（日本东京）产品；荧光染料Hoechst 33258、甲羟戊酸（ mevalonic acid， MEV）和碘化丙啶（propidium iodide， PI）染色液（PI 100 g/L， 1% Triton 100， 9 g/L NaCl），Sigma公司产品。流式细胞仪，2000 FCA，美国BD公司产品。

　　1.2 实验方法

　　1.2.1 细胞培养 人肝癌细胞株HepG 2（美国ATCC公司产品）在含10%胎牛血清的DMEM培养基、5% CO2、37 ℃条件下培养。实验中，细胞种植于适当培养皿中，90%的细胞融合时，用磷酸盐缓冲液洗净后，加入适量含有NK-104和MEV（ 1 mmol/L ）等药物的培养液，37 ℃培养箱中培养。

　　1.2.2 WST-8方法 利用WST-8试剂盒对细胞增殖进行测定。HepG 2细胞（1×104个细胞/孔）接种于含100 μl培养液的96孔培养板中，NK-104（ 0.1 ～100 μmol/L）治疗48 h后，分别加入WST-8试剂10 μl（日本同仁化学研究所）培养2 h后，选择450 nm波长，测定各孔的吸光度OD值。

　　1.2.3 Hoechst 33258染色 细胞经药物刺激 48 h 后，甲醇-冰乙酸（3∶1）细胞固定液4 ℃固定5 min，磷酸盐缓冲液稍洗后，点加Hoechst 33258染色液， 10 min .用滤纸沾去多余液体，封片剂封片后荧光显微镜观察细胞核碎片。

　　1.2.4 流式细胞仪检测凋亡峰 在室温下将刺激48 h后的细胞用冷磷酸盐缓冲液洗涤2次，并在适当的染色缓冲液中吸取100 μl的细胞（1×105）至试 管中。加入200 μl RNase A，37 ℃水浴30 min，再加800 μl PI染色液混匀，4 ℃避光30 min后，立即上机分析。

　　1.2.5 半胱氨酸蛋白酶3比色法 经药物治疗 48 h 后收集细胞，采用半胱氨酸蛋白酶3比色法试剂盒按照厂家说明进行测定（Medical & Biological Laboratories Co.， LTD， Japan）。

　　1.3 统计学方法 数据均以 x ± s 表示，采用SPSS 11.0统计软件进行统计分析，采用 t 检验。

　　2 结果

　　2.1 NK-104对HepG 2细胞增殖的抑制作用 为了确定NK-104在人肝癌细胞HepG 2中的治疗浓度，采用WST-8方法对细胞的增殖作用进行测定。与对照组相比，NK-104在10和100 μmol/L时，对HepG 2细胞生长均有明显的抑制作用。 100 μmol/L 时，近50%的细胞死亡（ P <0.01）。见图1.

　　图1 不同浓度NK-104对HepG 2生长的抑制作用（略）

　　Figure 1 Growth inhibition of HepG 2 cells by NK-104

　　**P <0.01， vs control group.

　　2.2 NK-104诱导细胞凋亡的形态变化 对照组细胞界限清晰，胞浆丰富，细胞核呈弥散、均匀荧光分布，经10～100 μmol/L NK-104处理后，HepG 2发生细胞凋亡，细胞核或细胞质内可见浓染致密的蓝色荧光颗粒及明显核形态变化。见图2.

　　2.3 NK-104对HepG 2细胞周期的影响 与对照组相比，NK-104治疗组可明显诱导HepG 2的细胞凋亡，出现相当比例的DNA含量小于二倍体的亚G1凋亡峰（24%），不同周期细胞的比例也发生变化，与MEV共同作用后可消除NK-104的这种诱导作用。见图3.

　　2.4 NK-104对caspase-3活性的影响 与对照组相比，NK-104可明显诱导caspase-3活性（ P < 0.01 ），同样加入MEV能够消除NK-104的这种诱导作用。见图4.

　　图2 NK-104处理48 h后HepG 2细胞核的形态变化（Hoechst33258染色， ×400）（略）

　　Figure 2 Nuclear morphology of the HepG 2 cells treated by NK-104 for 48 hours （Hoeschst 33258 staining， ×400）

　　A： Control， normal nuclear structure； B： NK-104 10 μmol/L； C： NK-104 100 μmol/L； ●： Cytoplasmic change； ■： Nuclear fragmentation.

　　图3 NK-104治疗HepG 2细胞后细胞周期分布变化（略）

　　Figure 3 Cell cycle analysis of HepG 2 cells treated by NK-104 （Percentage of Sub G1cells）

　　**P <0.01， vs control group. A： Control； B： NK-104 10 μmol/L； C： NK-104+MEV.

　　图4 NK-104对caspase-3活性的影响（略）

　　Figure 4 NK-104 induced activity of caspase-3

　　**P <0.01， vs control group. The HepG 2 cells were exposed to NK-104 （10 μmol/L） alone， or NK-104 （10 μmol/L） plus MEV （1 mmol/L） for 48 hours. The caspase-3 activity was measured with a colorimetric protease assay.

　　3 讨论

　　目前认为恶性肿瘤是一种多基因异常的疾病，其发生的分子基础是原癌基因的激活或抑癌基因的突变失活或缺失，导致某些细胞分化不良、凋亡受阻和增殖失控而形成肿瘤。原发性肝癌约55%发生在中国［6］。肝癌细胞的凋亡在肝癌的发生发展、转归 及治疗等方面均有重要的意义。HMG-CoA还原酶抑制剂，是重要的脂类合成抑制剂，临床上广泛应用于治疗高脂血症。最近研究表明，HMG-CoA还原酶抑制剂具有抗感染、降低炎性细胞因子水平及抗癌等生物学多效性作用。Otsuki等［7］报道1～30 μmol/L的西米伐他汀 （simvastatin） 具有预防癌症的作用。Sutter等［8］研究认为1～10 μmol/L的弗鲁伐他汀（fluvastatin）通过诱导Huh 7细胞凋亡而抑制肝癌细胞的增殖。Denoyelle等［9］认为25 μg/L的赛里伐他汀（cerivas-tatin）对MDA-MB-231人乳腺癌细胞通过抑制细胞核因子κB活性起到重要的抗转移作用。HepG 2细胞具有典型肝癌细胞的一系列恶性特征，是研究和评价防治肝癌药物的较理想的细胞模型。NK-104是日本新近研制的第三代HMG-CoA还原酶抑制剂，具有副作用小、高效和强力的药代动力学特点［4］。我们的研究结果表明，NK-104对HepG 2细胞增殖有明显抑制作用，其最大抑制率可达50%左右，使HepG 2细胞呈现典型的凋亡形态学特征，核质浓集，有凋亡小体。提示NK-104能在一定程度上抑制肝癌细胞的增殖。流式细胞术具有检测的细胞数量大、反映群体细胞的凋亡状态比较准确等优点［10］。NK-104作用于HepG 2细胞后，通过流式细胞仪分析，与对照组相比，可见凋亡细胞出现在直方图亚二倍体峰位置，并与细胞主峰G0/G1分界清楚，可定量凋亡占整个细胞群百分比。本研究结果表明，NK-104可明显诱导HepG 2细胞凋亡。细胞凋亡的核心成分是半胱氨酸蛋白酶家族（caspase），其中研究最多，功能相对较明确的为caspase-3.caspase-3是哺乳动物细胞凋亡的关键蛋白酶之一，为凋亡的效应分子，被称为凋亡的“执行者”［11～13］。激活的caspase-3可裂解相应的胞核内底物DNA修复酶（poly ADP-ribose polymerase， PARP），使PARP失去对DNA的修复功能，导致细胞转向凋亡［14］。本研究表明，10 μmol/L NK-104能够增强caspase-3的活性，加入MEV能够消除NK-104的这种诱导作用。这一研究结果表明，NK-104诱导HepG 2细胞凋亡与激活caspase-3依赖性凋亡调节信号通路有关。

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