【摘要】  通过观察实验豚鼠胆囊细胞钙离子浓度（［Ca 2+］i）的变化，探讨胆固醇结石形成与养肝柔肝中药防治胆结石的作用机制。方法：将80只受试豚鼠随机分为正常对照组、模型组、养肝柔肝中药组和熊去氧胆酸组，每组20只。后三组采用高胆固醇致石食饵诱发法建立豚鼠胆结石动物模型，其中养肝柔肝中药组、熊去氧胆酸组分别给予相应药物进行防治实验，连续用药7周后，分别对实验豚鼠大体情况、胆结石生成情况以及胆囊细胞［Ca2+］i的变化进行观察。结果：模型组动物胆囊细胞［Ca 2+］i明显降低，养肝柔肝中药不仅能明显改善豚鼠行为学体征，降低胆结石的成石率，而且可提高胆囊细胞［Ca2+］i.结论：胆囊细胞［Ca2+］i降低是导致胆囊的收缩功能降低，胆固醇结石形成的重要因素。提高胆囊细胞［Ca2+］i，增强胆囊平滑肌细胞的收缩功能，减轻胆汁淤滞，可能是养肝柔肝中药防治胆石病的作用机制之一。

　　【关键词】  胆固醇

　　我国胆石病呈较快的上升趋势，部分地区患病率已达10%［1］，接近世界发达国家胆石病10%～15%的发病水平［2］。胆石病仍是我国良性胆道疾患中致死、致残的重要原因。我们的前期研究工作表明，养肝柔肝中药对胆石病具有一定的临床疗效［3，4］。本实验以高胆固醇饮食诱发豚鼠胆结石，采用流式细胞术（flow cytometry， FCM）测定实验豚鼠胆囊细胞钙离子浓度［Ca2+］i，以探讨养肝柔肝中药防治胆囊结石形成的作用机制。

　　1 材料与方法

　　1.1 实验动物 选用白色、红目豚鼠，雌雄各半，清洁级，体质量（220±20）g，共80只，由上海中医药大学实验动物中心提供。

　　1.2 主要试剂、药物与仪器

　　1.2.1 实验试剂和药物 Fluo-3，AM荧光染料，美国Molecular Probes公司产品；养肝柔肝中药采用养肝利胆颗粒（何首乌、枸杞子、白芍药、陈皮、甘草），8 g/包，每克相当于含原药材4.5 g，由上海中医药大学龙华医院制剂室提供；熊去氧胆酸 （ursodeoxycholic acid， UDCA），上海三维长江生化制药厂产品，批号为200304005，10 mg/片。

　　1.2.2 主要仪器 Mgna FTIR-750型红外光谱仪，美国Thermo Nicolet公司产品；LG-10低温高速离心机，北京医用离心机厂产品；Facscalibour流式细胞仪，美国Becton Dickinson公司产品。

　　1.3 动物分组、造模及药物处理 所有豚鼠饲养于上海中医药大学实验动物中心动物室，室温（23±10）℃，适应性喂养1周，无怀孕及不良反应，饮食、饮水正常者，即纳入实验。实验豚鼠随机分为正常对照组、模型组、熊去氧胆酸组和养肝柔肝中药组，每组各20只。采用高胆固醇致石食饵诱发法建立豚鼠胆囊胆固醇结石动物模型［5］，正常对照组喂正常饲料及青菜适量，模型组喂以致石饲料及少量青菜，各治疗组在喂以相当于模型组的致石饲料及青菜的同时给以药物灌胃。药物以成人用药剂量（ 60 kg 体质量，养肝利胆颗粒18 g/d、UDCA 300 mg/d） 按体型系数换算［6］，养肝柔肝中药组给以养肝利胆颗粒1.81 g/（kg.d），熊去氧胆酸组给以UDCA 30.12 mg/（kg.d），模型组和正常对照组豚鼠灌胃等容量的生理盐水，连续7周。

　　1.4 标本采集与处理

　　1.4.1 标本采集 各组动物均于第7周末取材。 以15%乌拉坦腹腔注射麻醉，活体下肉眼观察胆汁中成石情况，然后完整切除胆囊后，再仔细观察胆囊内成石情况，收集胆石。完整切除胆囊后冷冻保存标本。

　　1.4.2 标本处理 取豚鼠胆囊修剪成米粒大小，用医用剪刀剪碎，同时不断用PBS冲洗，获得细胞悬液后用40 μm的尼龙网过滤，再用PBS冲洗两遍， 1 500 r/min离心5 min，弃去上清液，调节细胞数至每管106个细胞，分别加入A、B管中，在A管中加入PBS，B管中加入Fluo-3荧光素，混匀后放在暗处，室温下静止45 min，PBS冲洗一遍上机待测。

　　1.5 胆石红外光谱定性 采用溴化钾压片法测定胆结石样品。

　　1.6 胆囊细胞［Ca2+］i的测定 参考文献［7］，使用Facscalibour流式细胞仪检测，利用CELL-Quelt功能软件进行参数的获取和数据分析。

　　1.7 统计学方法 计量资料用 x ±s 表示，组间均数比较采用方差分析。计数资料采用率或构成比表示，采用χ2检验方法。所有运算程序均在计算机上运用SPSS 11.0统计软件包进行。

　　2 结果

　　2.1 豚鼠大体情况 正常对照组豚鼠表现为体质量自然增加，反应灵活，活动敏捷，被毛密集而有光泽、紧贴皮肤，鼻、唇湿润清洁，眼睛明亮，大便正常，在饲养过程中无死亡。模型组动物表现饮食减少，生长缓慢，被毛干枯、蓬松且易脱落，活动迟缓，反应迟钝，眼睛、鼻、唇、耳、尾部色淡少泽。熊去氧胆酸组和养肝柔肝中药组豚鼠行为学表现、体质量和营养状况等方面与模型组比较有明显改善，但不能恢复到正常对照组水平。模型组豚鼠在造模30 d后有3只动物死亡，经解剖胆囊发现有2只豚鼠胆囊发生结石。养肝柔肝中药组、熊去氧胆酸组各有 2只 动物死亡，这两组死亡豚鼠经解剖胆囊均未发现明显结石生成。由于上述三组共计7只豚鼠死时未达造模的时间要求，所以没有计入成石率的结果，也未作为标本采集的来源。

　　2.2 胆石定性 肉眼所见胆囊结石呈胆石泥砂或絮状沉淀。经红外光谱检测分析为胆固醇结石。

　　2.3 豚鼠胆囊结石生成情况 以肉眼观察可见胆囊内有块状及絮状沉淀物并经红外光谱鉴定为胆固醇结石。正常对照组中1只动物无胆囊而没有计入成石率的统计，其余19只动物中有1只发生胆石，成石率为5.26%.模型组动物中除3只死亡外，其余17只动物中有14只出现胆石，成石率为 82.35% ，明显高于正常对照组（ P <0.01）。养肝柔肝中药组18只动物中有5只出现胆石，熊去氧胆酸组18只动物中有7只出现胆石，养肝柔肝中药组和熊去氧胆酸组成石率分别为27.78%和38.89%，均明显低于模型组胆石生成率（ P <0.05）。

　　2.4 胆囊细胞［Ca2+］i测定结果 随机抽取保存的豚鼠胆囊组织，上述4组每组各8份，测定各组胆囊细胞［Ca2+］i.正常对照组胆囊细胞［Ca2+］i为（82.77±12.45）nmol/L，模型组为（18.52± 11.97）nmol/L ，熊去氧胆酸组为（44.79± 8.94）nmol/L ，养肝柔肝中药组为（72.86± 10.68）nmol/L .结果显示，模型组胆囊细胞［Ca 2+］i较正常对照组明显降低（ P <0.01）；养肝柔肝中药组和熊去氧胆酸组均可升高胆囊细胞［Ca2+］i，与模型组相比，差异均有统计学意义（ P <0.01）；但养肝柔肝中药组与正常对照组无明显差异（ P > 0.05 ），熊去氧胆酸组与正常对照组相比，差异有统计学意义（ P <0.01）；养肝柔肝中药组与熊去氧胆酸组相比，差异有统计学意义（ P <0.01）。

　　3 讨论

　　随着人口的老龄化与饮食结构的改变，我国胆结石的患病种类发生了很大的变化，尤其是近20年来，胆囊结石约占胆石病发病的80%［8］，以胆固醇为主要成分的胆囊结石已成为我国胆结石的主要类型［1，9］。因此，我们在本研究中选择了高胆固醇致石食饵诱发法建立豚鼠胆固醇结石的动物模型。朱培庭教授［3］在总结我院著名中医外科专家顾伯华教授和中西医结合专家徐长生教授治疗胆石病经验的基础上，对274例慢性胆道感染、胆石病病人进行辨证分析发现，肝阴不足证型占66.66%，并且50岁以上年龄者高达72.37%，这与《内经》“年四十而阴气自半也，起居衰矣”（《素问。阴阳应象大论》）的理论及朱丹溪“阳常有余，阴常不足”之论相吻合。对肝阴不足证型胆石病患者予验方养肝利胆方药治疗显示了良好的效果，有效率达84.13%［3，4］。养肝利胆颗粒剂由何首乌、枸杞子、白芍、陈皮、甘草等组成。方以何首乌、枸杞子、白芍滋养肝阴。其中何首乌补肝肾、益精血；枸杞子味甘平而润，性滋而补，能生精益气；白芍苦酸微寒，能养血敛阴，柔肝止痛；陈皮苦辛温，能理气健脾，且能防滋阴药过于滋腻之弊。纵览全方切合疏肝利胆的治疗大法，体现了“胆病从肝论治”之学术思想。在平滑肌收缩与舒张的信号转导机制中，细胞 内游离钙作为一种重要的第二信使广泛地参与细胞的运动、分泌、代谢和分化等多种细胞功能活动的调节。［Ca2+］i的降低是平滑肌细胞舒张的关键因素之一，调节平滑肌收缩的主要蛋白有肌球蛋白轻链、原肌球蛋白和调钙蛋白的结合蛋白等。平滑肌细胞中收缩相关蛋白参与平滑肌细胞收缩、收缩的调节及细胞骨架的构成，这些蛋白的活性在一定程度上均受到［Ca2+］i的调节［10，11］。已有研究表明，胆囊平滑肌细胞［Ca2+］i的降低，是导致平滑肌收缩功能障碍的重要原因。本研究表明，模型组豚鼠胆囊细胞［Ca2+］i明显降低，养肝柔肝中药不仅能有效降低胆结石的生成，而且可明显提高胆囊细胞［Ca2+］i.胆囊细胞［Ca2+］i通过与相关钙结合蛋白结合，间接调节蛋白的磷酸化，对细胞外信号作出应答，以增强胆囊平滑肌细胞的收缩，减轻胆汁淤滞，这可能是养肝柔肝中药治疗胆石病作用的重要机制之一。

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