大肠杆菌感受态细胞的制备和转化

　　第一节 概 述

　　在自然条件下，很多质粒都可通过细菌接合作用转移到新的宿主内，但在人工构建的质粒载体中，一般缺乏此种转移所必需的mob基因，因此不能自行完成从一个细胞到另一个细胞的接合转移。如需将质粒载体转移进受体细菌，需诱导受体细菌产生一种短暂的感受态以摄取外源DNA.

　　转化（Transformation）是将外源DNA分子引入受体细胞，使之获得新的遗传性状的一种手段，它是微生物遗传、分子遗传、基因工程等研究领域的基本实验技术。

　　转化过程所用的受体细胞一般是限制修饰系统缺陷的变异株，即不含限制性内切酶和甲基化酶的突变体（Rˉ，Mˉ），它可以容忍外源DNA分子进入体内并稳定地遗传给后代。受体细胞经过一些特殊方法（如电击法，CaCl2 ，RbCl（KCl）等化学试剂法）的处理后，细胞膜的通透性发生了暂时性的改变，成为能允许外源DNA分子进入的感受态细胞（Compenent cells）。进入受体细胞的DNA分子通过复制，表达实现遗传信息的转移，使受体细胞出现新的遗传性状。将经过转化后的细胞在筛选培养基中培养，即可筛选出转化子（Transformant，即带有异源DNA分子的受体细胞）。目前常用的感受态细胞制备方法有CaCl2和RbCl（KCl）法，RbCl（KCl）法制备的感受态细胞转化效率较高，但CaCl2 法简便易行，且其转化效率完全可以满足一般实验的要求，制备出的感受态细胞暂时不用时，可加入占总体积15％的无菌甘油于-70℃保存（半年），因此CaCl2法为使用更广泛。

　　为了提高转化效率， 实验中要考虑以下几个重要因素：

　　1. 细胞生长状态和密度： 不要用经过多次转接或储于4℃的培养菌，最好从－70℃或-20℃甘油保存的菌种中直接转接用于制备感受态细胞的菌液。细胞生长密度以刚进入对数生长期时为好，可通过监测培养液的OD600 来控制。DH5α菌株的OD600 为0.5时，细胞密度在5×107 个/ml左右（不同的菌株情况有所不同），这时比较合适。密度过高或不足均会影响转化效率。

　　2. 质粒的质量和浓度： 用于转化的质粒DNA应主要是超螺旋态DNA（cccDNA）。转化效率与外源DNA的浓度在一定范围内成正比，但当加入的外源DNA的量过多或体积过大时，转化效率就会降低。1ng的cccDNA即可使50μl 的感受态细胞达到饱和。一般情况下，DNA溶液的体积不应超过感受态细胞体积的5％。

　　3. 试剂的质量： 所用的试剂，如CaCl2 等均需是最高纯度的（GR.或AR.），并用超纯水配制，最好分装保存于干燥的冷暗处。

　　4. 防止杂菌和杂DNA的污染：整个操作过程均应在无菌条件下进行， 所用器皿， 如离心管， tip头等最好是新的，并经高压灭菌处理，所有的试剂都要灭菌，且注意防止被其它试剂、DNA酶或杂DNA所污染， 否则均会影响转化效率或杂DNA的转入， 为以后的筛选、鉴定带来不必要的麻烦。

　　本实验以E.coli DH5a菌株为受体细胞，并用CaCl2处理，使其处于感受态，然后与pBS质粒共保温，实现转化。由于pBS质粒带有氨苄青霉素抗性基因（Ampr ），可通过Amp抗性来筛选转化子。如受体细胞没有转入pBS，则在含Amp的培养基上不能生长。能在Amp培养基上生长的受体细胞（转化子）肯定已导入了pBS.转化子扩增后，可将转化的质粒提取出，进行电泳、酶切等进一步鉴定。

　　本实验以E.coli DH5a菌株为受体细胞，并用CaCl2处理，使其处于感受态，然后与pBS质粒共保温，实现转化。由于pBS质粒带有氨苄青霉素抗性基因（Ampr ），可通过Amp抗性来筛选转化子。如受体细胞没有转入pBS，则在含Amp的培养基上不能生长。能在Amp培养基上生长的受体细胞（转化子）肯定已导入了pBS.转化子扩增后，可将转化的质粒提取出，进行电泳、酶切等进一步鉴定。

　　第二节 材料、设备及试剂

　　一。 材料

　　E. coli DH5α菌株： Rˉ，Mˉ，Ampˉ；pBS质粒DNA： 购买或实验室自制，eppendorf管。

　　二。 设备

　　恒温摇床，电热恒温培养箱，台式高速离心机，无菌工作台，低温冰箱， 恒温水浴锅， 制冰机， 分光光度计，微量移液枪。

　　三。 试剂

　　1.LB固体和液体培养基：配方见第一章。

　　2.Amp母液：配方见第一章。

　　3.含Amp的LB固体培养基：将配好的LB固体培养基高压灭菌后冷却至60℃左右，加入Amp储存液，使终浓度为50ug/ml，摇匀后铺板。

　　4.麦康凯培养基（Maconkey Agar）：取52g麦康凯琼脂，加蒸馏水1000ml，微火煮沸至完全溶解，高压灭菌，待冷至60℃左右加入Amp储存液使终浓度为50ug/ml，然后摇匀后涂板。

　　5.0.05mol/L CaCl2溶液：称取0.28g CaCl2（无水，分析纯），溶于50ml重蒸水中，定容至100ml，高压灭菌。

　　6.含15%甘油的0.05mol/L CaCl2： 称取0.28g CaCl2（无水，分析纯），溶于50ml重蒸水中，加入15ml甘油，定容至100ml，高压灭菌。

　　第三节 操作步骤

　　一、 受体菌的培养

　　从LB平板上挑取新活化的E. coli DH5α单菌落，接种于3-5ml LB液体培养基中，37℃下振荡培养12小时左右，直至对数生长后期。将该菌悬液以1：100-1：50的比例接种于100ml LB液体培养基中，37℃振荡培养2-3小时至OD600 ＝0.5左右。

　　二、 感受态细胞的制备 （ CaCl2 法）

　　1、将培养液转入离心管中，冰上放置10分钟，然后于4℃下3000g离心10分钟。

　　2、 弃去上清，用预冷的0.05mol/L的CaCl2 溶液10ml轻轻悬浮细胞，冰上放置15-30分钟后，4℃下3000g离心10分钟。

　　3、弃去上清，加入4ml预冷含15%甘油的0.05mol/L的CaCl2 溶液，轻轻悬浮细胞，冰上放置几分钟，即成感受态细胞悬液。

　　4、 感受态细胞分装成200μl的小份，贮存于-70℃可保存半年。

　　三、 转化

　　1、从-70℃冰箱中取200μl感受态细胞悬液，室温下使其解冻，解冻后立即置冰上。

　　2、 加入pBS质粒DNA溶液（含量不超过50ng，体积不超过10μl），轻轻摇匀，冰上放置30分钟后。

　　3、42℃水浴中热击90秒或37℃水浴5分钟，热击后迅速置于冰上冷却3-5分钟。

　　4、向管中加入1ml LB液体培养基（不含Amp），混匀后37℃振荡培养1小时，使细菌恢复正常生长状态，并表达质粒编码的抗生素抗性基因（Ampr ）。

　　5、将上述菌液摇匀后取100μl 涂布于含Amp的筛选平板上，正面向上放置半小时，待菌液完全被培养基吸收后倒置培养皿，37℃培养16-24小时。

　　同时做两个对照：

　　对照组1： 以同体积的无菌双蒸水代替DNA溶液，其它操作与上面相同。此组正常情况下在含抗生素的LB平板上应没有菌落出现。

　　对照组2： 以同体积的无菌双蒸水代替DNA溶液，但涂板时只取5μl 菌液涂布于不含抗生素的LB平板上，此组正常情况下应产生大量菌落。

　　四、 计算转化率

　　统计每个培养皿中的菌落数。

　　转化后在含抗生素的平板上长出的菌落即为转化子，根据此皿中的菌落数可计算出转化子总数和转化频率，公式如下：

　　转化子总数＝菌落数×稀释倍数×转化反应原液总体积／涂板菌液体积

　　转化频率（转化子数／每mg质粒DNA）＝转化子总数／质粒DNA加入量（mg）

　　感受态细胞总数＝对照组2菌落数×稀释倍数×菌液总体积／涂板菌液体积

　　感受态细胞转化效率＝转化子总数／感受态细胞总数

　　[注意] 本实验方法也适用于其它E.coli受体菌株的不同的质粒DNA的转化。但它们的转化效率并不一定一样。有的转化效率高，需将转化液进行多梯度稀释涂板才能得到单菌落平板，而有的转化效率低，涂板时必须将菌液浓缩（如离心），才能较准确的计算转化率。