【摘要】  通过乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase， LDH）的检测，观察解毒通络药物干预后的脑微血管内皮细胞条件培养液（ conditioned medium of cerebral microvascular endothelial cells， CMECs-CM）特征及其抗缺血及再灌皮质神经元损伤的效应，探讨脑微血管内皮细胞（cerebral microvascular endothelial cells， CMECs）调控神经元功能的机制。方法：通络救脑注射液（Tongluo Jiunao Injection， TLJNI）作用于正常、缺血和缺血再灌三种培养状态的大鼠CMECs，分别收集有药物干预及无干预的三对无血清内皮细胞条件培养液，并测定其LDH值。同步原代培养大鼠脑皮质神经元，亦分为正常、缺血、缺血再灌三组，用低（10%）、中（50%）、高（100%）三种浓度的各类CMECs-CM分别作用上述三种培养状态的神经元，测定其LDH漏出率。结果：比较TLJNI干预后的CMECs-CM与无干预的CMECs-CM中LDH漏出值，CMECs缺血组与缺血再灌组经药物干预后均明显降低（ P <0.01）。对于缺血神经元，缺血内皮细胞条件培养液（conditioned medi-um of ischemic CMECs， Is-CM）高浓度（100%）和TLJNI干预后的缺血内皮细胞条件培养液（conditioned medium of ischemic CMECs with drug treatment， IsT-CM）高浓度（100%）作用后表现为增加LDH漏出率（ P <0.01），而低浓度10%的IsT-CM则降低LDH漏出率（ P <0.05 ）；对于缺血再灌神经元，与对照组比较，各类CMECs-CM作用后均能降低神经元LDH漏出率（ P <0.05 或 P <0.01）。比较每种条件液相邻浓度间的效应差异，均以10%或50%的CM降低损伤为佳，正常内皮细胞条件培养液（conditioned medium of normal CMECs， N-CM）及缺血再灌内皮细胞条件培养液（conditioned medium of ischemic/reperfusional CMECs， Rp-CM）组间差异有统计学意义（ P <0.05或 P <0.01 ）；对于正常神经元，各类CMECs-CM作用后均增加了神经元LDH漏出率（ P <0.05或 P <0.01 ）。比较每种条件液相邻浓度间的效应差异，N-CM组间差异有统计学意义（ P <0.05或 P <0.01 ）。结论：TLJNI能够防御CMECs缺血及缺血再灌的损伤，可以通过内皮细胞介导发挥抗缺血及缺血再灌神经元损伤的效应。提示CMECs-CM及TLJNI干预后的CMECs-CM均存在着抗缺血再灌神经元损伤的活性物质。

　　【关键词】  脑微血管内皮细胞； 神经元； 脑缺血； 大鼠； 中药

　　近年来中药调节脑微血管内皮的研究日益受到人们的重视［1～3］，但整体动物实验无法将内皮细胞与脑细胞分离开来进行研究，本实验室采用大鼠大脑皮质微血管内皮细胞和神经元分离纯化培养的方法，可使其纯度分别达到98%，是研究二者之间关系的一种可靠的实验方法。通络救脑注射液（Tongluo Jiunao Injection， TLJNI）是治疗缺血性脑病的中药新药。初步实验证实，TNJNI在缺血内皮细胞损伤状态下具有可靠的维护脑微血管内皮功能的作用［4，5］。这种对脑微血管内皮细胞（cerebral microvascular endothelial cells， CMECs）的保护作用是否启动进一步的脑保护效应有待探知。本实验通过观察CMECs缺血损伤及通络救脑注射液干预后的不同条件培养液（conditioned medium， CM）抗缺血神经元损伤的效应，探讨CMECs与神经元的功能联系，并进一步阐明通络救脑注射液的“解毒通络”作用机制，对于深化“毒损脑络”病机［6］的生物学理论内涵具有重要意义。

　　1 材料与方法

　　1.1 实验材料

　　1.1.1 动物 雄性SD大鼠18只，体质量 60～80 g ，用于同一批CMECs原代培养。新生SD大鼠（24 h内）4只，用于同一批原代神经元培养。动物合格证号为SCXK京2002-0003，清洁级，购自北京维通利华实验动物中心。

　　1.1.2 药物 通络救脑注射液，批号为04061011，购自内蒙古康源药业有限公司。 药物组成为栀子和三七，提取分离有效成分栀子苷和三七总皂苷，配伍制成注射液，该注射液含原药有效成份为 7.7 mg/ml.

　　1.2 实验方法 通过乳酸脱氢酶（lactate dehydro-genase， LDH）的检测，观察正常、缺血及缺血再灌不同状态的脑微血管内皮细胞条件培养液（condi-tioned medium of cerebral microvascular endotheli-al cells， CMECs-CM）和 TLJNI干预后的CMECs-CM抗缺血及缺血再灌皮质神经元损伤的特征效应。

　　1.2.1 解毒通络药物干预后的CMECs-CM的收集

　　1.2.1.1 CMECs的培养 雄性SD大鼠18只，体质量60～80 g，用于同一批CMECs原代培养。无菌条件下取出双侧大脑半球，置预冷的冲洗液（DMEM培养液，10%新生牛血清、青霉素 1×105U/L ，链霉素1×10 5U/L）中，剔除软脑膜、表面血管及白质，收集皮质。剪碎成1 mm 3的小块，置手动玻璃匀浆器，冰上操作上下匀浆约25次。依次通过80目和200目尼龙网过滤，收集200目滤网上微血管段。用0.1%胶原酶，37 ℃消化30 min.冲洗液冲洗两遍，1 000 r/min（RCF：201× g ）离心 5 min ，将微血管段重悬于完全培养基DMEM培养液，胎牛血清20%；内皮细胞生长支持物（endotheli-al cells growth support， ECGS）75 mg/L、肝素钠 4× 10 4U/L、青霉素1×105U/L、链霉素 1×105U/L 、胰岛素200 U/L、 L -谷氨酰胺 2 mmol/L 中，接种于2%明胶预先包被的25 cm 2培养瓶（Costar公司）中，共3瓶，37 ℃、5%CO2培养箱静置培养48 h后，第1次换液。第7天细胞基本融合成片，进行消化传代，消化液为体积比为1∶1的 0.125% 的胰蛋白酶与0.02% EDTA.

　　二代经过Ⅷ因子免疫荧光鉴定，其纯度可达98%.培养的第二代CMECs 90%汇合后经消化后再传代，传到25 cm2培养瓶共12瓶。本实验用第三代细胞，将实验细胞分为正常、缺血（ischemia， Is）和缺血再灌（ischemia/reperfusion， I/R）三组各4瓶，每组又分为2瓶加TLJNI药物干预，2瓶无药物干预，用以收集CMECs-CM.

　　1.2.1.2 条件培养液的收集 CMECs随机分为正常、缺血和缺血再灌三组，分别收集解毒通络药物干预及无干预的三对无血清CMECs-CM.解毒通络干预药物为通络救脑注射液。给药方式采用容积单位为计算单位，根据预实验确定给药的终浓度剂量为40 μl/ml，设计药物作用时间是12 h.各样本均收集了10 ml条件液，分装1 ml eppendorf管，置-20 ℃冻存备用。正常CMECs条件培养液（conditioned medium of normal CMECs， N-CM）及药物干预的正常条件培养液（conditioned medium of normal CMECs with drug treatment， NT-CM）收集：正常培养的CMECs及TLJNI干预12 h后的CMECs弃去完全培养液，D-Hank‘s冲洗两遍，换上无血清DMEM培养液， 37 ℃、5% CO2培养箱继续培养 12 h .收集DMEM培养液，4 ℃、2 500 r/min（RCF：1 258× g ）离心20 min，取上清即N-CM及NT-CM.缺血内皮细胞条件培养液（conditioned medi-um of ischemic CMECs， Is-CM）及TLJNI干预的缺血条件培养液（conditioned medium of ischemic CMECs with drug treatment， IsT-CM）收集：采用氧糖剥夺（oxygen and glucose deprivation， OGD）法模拟在体缺血，药物干预组造模前预用药 6 h ，方法同正常干预组。造模时弃去完全培养液，以D-Hank’s 冲洗细胞两遍，换Kreb‘s溶液（NaCl 119 mmol/L 、 KCl 4.7 mmol/L、KH 2PO41.2 mmol/L 、NaHCO325 mmol/L、CaCl22.5 mmol/L、MgCl21 mmol/L ）；药物干预组换上含药的Kreb’s液。置37 ℃、93% N2+7% CO2自制的密闭缺氧罐中培养6 h.收集Kreb‘s培养液，4 ℃、2 500 r/min（RCF：1 258× g ）离心20 min，取上清即Is-CM及 IsT-CM .

　　缺血再灌内皮细胞条件培养液（conditioned mediumof ischemic/reperfusional CMECs， Rp-CM） 及TLJNI干预的缺血再灌条件培养液（conditioned medium of ischemic/reperfusional CMECs with drug treatment， RpT-CM）收集：缺血模型及药物干预同上，氧糖剥夺6 h后弃去Kreb‘s培养液，换上无血清DMEM培养液，置37 ℃、5%CO2培养箱继续再灌12 h，收集DMEM培养液， 4 ℃ 、 2 500 r/min（RCF：1 258× g ）离心20 min，取上清即Rp-CM及RpT-CM.

　　1.2.2 皮质神经元的原代培养 无菌分离新生SD大鼠的大脑皮层，经0.125%胰蛋白酶消化后制成细胞悬液，悬于接种培养液（DMEM培养液含10%马血清、10%胎牛血清、青霉素 1×105U/L、 链霉素1×105U/L）中，以1×109/L的细胞密度接种于预先涂有多聚赖氨酸的96孔培养板中培养。置 37 ℃ 、5% CO 2培养箱培养，24 h后换维持液（DMEM培养液、10%马血清、1%N3、青霉素 1×105U/L、 链霉素1×105U/L）。当细胞培养到第 3天 时加阿糖胞苷（10 -5mol/L），并持续作用72 h以抑制非神经细胞的增殖。之后换全液以去除阿糖胞苷的作用，继续培养3～4 d用于实验。

　　1.2.3 各类CMECs-CM分别作用正常、缺血及缺血再灌三组神经元 神经元细胞随机分为正常、缺血、缺血再灌三组，缺血模型及缺血再灌方法同CMECs.各类CMECs-CM均设低、中、高三种浓度分别诱导各组神经元。（1）对于正常组，弃去完全培养液，D-Hank‘s冲洗两遍，将收集的N-CM、 NT-CM 及Rp-CM、RpT-CM按0（即正常神经元对照组）、10%、50%和100%的浓度加入实验各孔（每个浓度做6个重复孔，即每孔加CM 0、10、50和 100 μl ，下同），余用DMEM培养液补足至100 μl.37 ℃、5% CO2培养箱继续培养12 h，之后检测LDH漏出率。（2）对于缺血组，将收集的Is-CM及IsT-CM按0（即缺血神经元对照组）、10%、50%和100%的浓度加入实验各孔之中，余用Kreb’s液补足至100 μl；另外还设立一组TLJNI（ 40 μl/ml ）直接作用缺氧神经元。置37 ℃、93% N2+7% CO2自制的密闭缺氧罐中培养6 h，之后检测LDH漏出率。（3）对于缺血再灌组，缺血模型同Is组，氧糖剥夺6 h后弃去Kreb‘s液，之后同正常组。将收集的N-CM、 NT-CM 及Rp-CM、RpT-CM按0（即缺血再灌神经元对照组）、10%、50%和100%的浓度加入实验各孔之中，余用DMEM培养液补足至100 μl.37 ℃、5% CO2培养箱继续再灌12 h，之后检测LDH漏出率。1.2.4 神经元细胞LDH漏出率测定 LDH试剂盒购自Promega公司，具体步骤参照说明书，终止反应后于酶标仪测定492 nm光密度值（optical density， OD）。测量内容包括：（1）将标准品系列稀释成不同浓度梯度，绘制出LDH标准曲线。（2）测定CMECs-CM（N-CM、NT-CM、Is-CM、IsT-CM、Rp-CM、RpT-CM）中LDH含量（DMEM液和Kreb’s液调零），一方面可了解CMECs各组CM中LDH的漏出情况，另一方面可用于校正神经元培养液上清的实际LDH值。（3）一一对应测定神经元培养液上清及细胞完全裂解后的LDH值。神经元培养液上清LDH的实际漏出值=测定值-校正值。神经元LDH的漏出率（%）=［培养液上清LDH值/（培养液上清LDH值+细胞裂解后LDH值）］×100.

　　1.3 统计学方法 数据以 x ± s 表示，行单因素方差分析。

　　2 结果

　　2.1 CMECs各组条件培养液中LDH的测定 图1示LDH的标准曲线。因试剂盒未提供阳性标准品的浓度，所以横坐标LDH的含量为标准品的体 积含量。纵坐标OD值在0～5之间即跨度很大范围内都与LDH的含量呈良好的线性关系，提示本实验方法稳定、统计可信。

　　图1 LDH标准曲线图（略）

　　Figure 1 Standard curve of lactate dehydrogenase

　　通过对各组的LDH测定，可以了解CMECs各组CM中LDH的漏出情况。比较TLJNI干预后的CMECs-CM与无干预的CMECs-CM，缺血组与缺血再灌组药物干预后LDH漏出值均明显降低（ P <0.05）；正常组药物干预后LDH漏出值略增高，但差异没有统计学意义（ P >0.05）。说明TLJNI能够防御CMECs缺血及缺血再灌的损伤。见表1.正常、缺血及缺血再灌组组间比较，缺血组LDH漏出最低，缺血组与正常组比较，差异有统计学意义（ P <0.01）；缺血再灌组漏出最高，与缺血组比较，差异有统计学意义（ P <0.01），提示CMECs缺血及再灌模型基本可靠。缺血组LDH漏出最低可能与其CM收集的时间有关，因其造模时间是6 h，故收集的是6 h的培养液，而正常及缺血再灌组收集的是12 h的条件培养液。见表1.

　　表1 TLJNI干预与未干预的各组CMECs-CM的LDH释放值比较（略）

　　Table 1 LDH release value of different CMECs-CM

　　* P <0.05， vs CM without drug treatment；△△P <0.01， vs normal CMECs-CM；▲▲P <0.01， vs ischemia CMECs-CM.

　　2.2 不同CMECs-CM分别作用不同状态神经元后的LDH漏出率 Is-CM不同浓度作用缺血神经元，与对照组即未做任何处理的缺氧神经元比较，仅表现为100%的Is-CM增加LDH漏出率（ P < 0.01 ）。IsT-CM作用后表现为100%的IsT-CM增加LDH漏出率（ P <0.01），而10%的IsT-CM组 降低LDH漏出率（ P <0.05）。不同浓度及组别的CM作用规律不一致，可能与所含活性物质不同，或所含活性因子的不同效价有关。见表2.TLJNI直接干预神经元，与对照组比较，LDH漏出率却明显增高（ P <0.01），可能与本实验的投药剂量（仅参照CMECs的给药方式）偏高有关。若CMECs-CM作用Is组神经元与药物直接作用组比较，则均表现为LDH漏出率降低（ P < 0.05 或 P <0.01），提示药物可通过内皮细胞介导发挥抗缺血神经元损伤的作用。见表2.

　　表2 CMECs-CM对缺血神经元LDH漏出率的影响（略）

　　Table 2 LDH leakage rate of ischemia neurons intervened by different CMECs-CM

　　*P <0.05，**P <0.01， vs untreated control group；△P <0.05 ，△△P <0.01， vs drug-treated group.

　　与对照组比较，各类CMECs-CM作用缺血再灌组神经元后均能降低神经元LDH漏出率（ P <0.05或 P <0.01），提示各类CMECs-CM都存在着抗再灌神经元损伤的活性物质。每种条件液相邻浓度间比较，均以10%或50%的CM降低损伤为佳，N-CM及Rp-CM组间差异有统计学意义（ P < 0.05 或 P <0.01），其余两组浓度间差异不显著，提示不同组间发挥作用的活性物质的不一致性及可能非单一活性物质作用的复杂性。见表3.

　　表3 CMECs-CM对正常组及缺血再灌组神经元 LDH漏出率的影响（略）

　　Table 3 LDH leakage rates of normal and ischemia/ reperfusion neurons intervened by different CMECs-CM

　　*P <0.05，**P <0.01， vs control without CM group；△P <0.05 ，△△P <0.01， vs the nearest pre-concentration group.

　　各类CMECs-CM作用于正常组神经元后均增加了神经元LDH漏出率（ P <0.05或 P <0.01）。每种条件液相邻浓度间比较，N-CM三组间差异有统计学意义（ P <0.05或 P <0.01），其余各组差异无统计学意义。见表3.

　　3 讨论

　　我们从以往的离体实验已知，TLJNI在缺血状态下具有可靠的维护脑微血管内皮功能的作用［4，5］，对于改善脑微灌流具有实际意义。这种对CMECs的保护作用是否启动进一步的脑保护效应有待探知。目前对中药保护脑缺血损伤的研究，多针对药物能否透过血脑屏障这一关键途径而开展，本实验收集了正常、缺血及解毒通络药物干预的各种无血清内皮细胞条件培养液，试图了解生理及病理状态下可能通过内皮细胞介导的对神经元发挥作用的途径和效应。结果表明对于缺血及再灌这种病理状态下的神经元，各类CMECs-CM都起到了一定的抗损伤效应。理论上假说应是不同类别的条件培养液对神经元的作用机制有着差别，可以预想各类条件培养液中分别蕴含着多种活性物质，我们更感兴趣的是所涉及的功能蛋白质是如何发挥作用。发挥作用的生物活性因子可能是一种或是多种，与条件培养液收集的时段有关。探索其作用机制还要考虑到动态变化诸如激活、失活、协同、拮抗、连锁等诸多因素的影响。本实验仅从细胞的LDH漏出率角度即代表着细胞膜损害的一个指标揭示了初步现象，表明TLJNI可通过内皮细胞介导发挥抗缺血神经元损伤的作用，提示各类CMECs-CM都存在着抗缺血及缺血再灌神经元损伤的活性物质。但该时段的内皮细胞条件培养液对正常神经元却表现为增加了LDH漏出率，即一定程度上增加了细胞膜损伤。我们知道脑微血管内皮及其紧密连接是血脑屏障的重要形态学基础，对维持中枢神经系统内环境的稳定具有重要意义。正常情况下，除氧和二氧化碳可以自由通过血脑屏障外，绝大多数物质通过血脑屏障进入中枢神经系统都有其特定的通道。血脑屏障选择性控制脑细胞间液与血液间的物质转运，维持脑细胞间液的平衡，从而保证了神经细胞内环境的稳定。体外研究内皮细胞分泌的活性物质直接作用于神经细胞，暂时忽略了血脑屏障选择性的屏障保护作用，可能是导致正常神经元细胞膜通透性增加的主要原因。但仍为我们进一步深入研究内皮细胞的合成和分泌功能，及其活性物质调节神经细胞功能的作用机制，提供了积极的启示。脑缺血损伤是众多脑系疾病的共同病理过程，阐明疾病的分子和细胞机制及药物作用的靶标，发展寻找新药的新理论、新技术、新方法［7］，相信会为治疗脑系疾病的中药现代化研究提供新的思路。研究报道内皮细胞具有强大的分泌功能［8］，探索已知的、未知的、好的、坏的脑微血管内皮细胞的调控机制具有重要意义。就中医而言，以毒邪和络病作为深入研究的切入点，是进一步提高脑血管疾病疗效的突破口所在［9］。目前，国内外许多学者已注意到微循环局部与整体全过程的联系，提出血管内皮细胞是某些致病因素的靶细胞［10，11］。我们以CMECS为切入点，诠释TLJNI“解毒通络”的作用机制，探索药物的有效“靶标”分子，对于深化“毒损脑络”病机［6］理论内涵具有重要意义。

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