【摘要】  建立脾肾虚型重症肌无力患者血清蛋白质双向电泳图谱，观察脾肾虚型重症肌无力患者与正常人血清蛋白质差异表达情况。方法：采用反复冻融法抽提血清蛋白质，以优化的双向电泳技术分离血清蛋白质，建立脾肾虚型重症肌无力患者与正常人血清蛋白质双向电泳图谱，并采用二维电泳图谱专用软件对所得结果进行图谱分析。采用基质辅助激光解吸电离-飞行时间质谱法对两组间比较所得目标蛋白质点进行质谱鉴定。结果：通过双向电泳，建立血清蛋白质双向电泳图谱，选取具有明显差异的蛋白点21个进行质谱鉴定，共鉴定出8种蛋白质。结论：通过蛋白质组技术快速建立脾肾虚型重症肌无力患者血清蛋白表达图谱及质谱分析，可为进一步研究其发病机制及治疗手段提供实验基础。

　　【关键词】  重症肌无力； 蛋白质组； 电泳； 乙酰胆碱受体

　　重症肌无力（myasthenia gravis， MG）主要是由乙酰胆碱受体（acetylcholine receptor， AchR）抗体介导的，补体参与，细胞免疫依赖性，针对神经肌肉接头处突触后膜上乙酰胆碱受体的自身免疫性疾病。对于MG的治疗至今仍缺乏有效手段。蛋白质组技术利用其核心技术双向电泳（two-dimen-sional gel electrophoresis， 2-DE）对组织或细胞总蛋白质进行分离［1］，并通过正常与疾病组织的差异表达蛋白比较，找到与该疾病相关的蛋白质分子。本研究通过建立脾肾虚型重症肌无力患者和正常人血清总蛋白质的双向电泳图谱，寻找有明显差异性表达的蛋白，对差异表达的蛋白进行鉴定和研究，为进一步研究MG发病机制以及MG诊断治疗提供实验基础。

　　1 材料与方法

　　1.1 血清采集 MG患者全血来自2004～2005年就诊于辽宁中医学院附属医院的门诊患者。根据典型临床表现、新斯的明试验、低频重复电刺激及单纤维肌电图等确诊，无其他自身免疫性疾病，未经其他免疫抑制治疗，并参照1994年版《中医病证诊断疗效标准》辨证为脾肾虚型。正常人血清取自同时期健康志愿者。-70 ℃冰箱冷冻保存备用。

　　1.2 主要试剂 固相pH梯度干胶条IPG strip（Amersham公司产品， 非线性pH 3～10， 7 cm）。3-［3-（胆酰胺基丙基）二甲氨基］丙磺酸盐｛3-［（3-cholamidopropyl） dimethylamino］-1-propanesul-fonate， CHAPS｝，二硫苏糖醇（DL-dithiothreitol， DTT），三丁基膦（tributyl phosphine， TBP），尿素，硫脲，碘乙酰胺（iodoacetamide， IAA），丙烯酰胺（acrylamide）、甲双丙烯酰胺（N， N‘-methylenebi-sacrylamide），四甲基乙二胺（N， N， N， N-tetram-ethyl-ethylenediamine， TEMED），过硫酰胺（am-monium persulfate， APS），三羟甲基氨基甲烷［tris （hydroxymethyl） aminomethane］、甘氨酸（glycine， Gly）和十二烷基磺酸钠（sodium dodecyl sulfate， SDS）均为Bio-Rad公司产品。琼脂糖为华美生物公司产品。其他试剂均使用国产分析纯试剂。所有溶液均用MilliQ水配制。

　　1.3 主要仪器 高速冷冻离心机，德国Eppendorf公司产品；EttanTMIPGphorⅡ，Amersham Biosci-ences公司产品；P-2000分光光度仪，Hitachi公司产品；SE-600电泳仪，Amersham公司产品；纯水装置，Millipore公司产品；GS-710光密度扫描仪，Bio-Rad公司产品；冷却水循环系统，Cole-Parmer公司产品；Bruker-Daltonics AutoFlex TOF-TOF LIFTMass Spectrometer，美国Bruker-Daltonics公司产品；LCQ Deca XP Plus，美国Thermo Finnigan公司产品。

　　1.4 双向电泳

　　1.4.1 血清总蛋白质的提取及定量 血清-70 ℃反复冻融4次后，用Agilent Multiple Affinity Re-moval Column处理去除高丰度蛋白。使用Agilent 5K超滤管进行浓缩除盐，冻干回收的样品，-70 ℃保存。用裂解液（9 mol/L 尿素、4% CHAPS、 65 mmol/L DTT和cocktail酶抑制剂）进行复溶，并采用考马斯亮蓝法进行蛋白质定量。

　　1.4.2 等电聚焦 自-20 ℃取出的胶条，室温下平衡10 min，以500 μg上样量在每份样本中加入上样缓冲液（8 mol/L尿素、2% CHAPS、1% Bio-lyte和1% TBP）以及标准蛋白质分子，上样于泡胀槽中，加入矿物油覆盖。程序设置如下：30 V 12 h，500 V 1 h，1 000 V 1 h，8 000 V 6 h.恒温20 ℃。等电聚焦电泳后IPG胶条在平衡液1（Tris-base 50 mol/L 、尿素 6 mol/L、甘油 30%、SDS 2%、溴酚蓝0.002%和DTT 100 mg）中于振荡器上振荡 15 min； 然后置入平衡液2（成分同平衡液1，用 400 mg 碘乙酰胺代替100 mg DTT）同样于振荡器上振荡15 min.

　　1.4.3 SDS-PAGE垂直电泳 采用12.5%的均匀SDS2聚丙烯酰胺凝胶（水23.2 ml，30%丙烯酰胺溶液32.46 ml，1.5 mol/L Tris-HCl缓冲液pH 8.8 20 ml，10% SDS 0.8 ml，10% APS 0.4 ml，TEMED 3.76 μl，胶总体积80 ml）。将平衡后的IPG胶条移至凝胶的上方，胶条一端放入低分子量蛋白质标准，0.5%的琼脂糖封胶。上下槽加入电极缓冲液（Tris 5 mmol/L，Gly 192 mmol/L和SDS 0.1%）。初始电流为每块胶40 mA，电泳20 min，然后以每块胶60 mA电流，直至溴酚蓝前沿。

　　1.4.4 银染色 电泳结束后，采用硝酸银染色法，通过固定，硝酸银染色，显影，停显及脱色，至背景清晰。

　　1.5 图像分析 每个样品常规进行3次二维电泳，用GS-710光密度扫描仪对电泳后的胶图分别进行扫描，所得扫描图像输入计算机，采用Image-master软件对图像进行背景消减、蛋白质点检测和校正，获取蛋白质点的位置坐标和表达量等分析。选取 Ratio ≥1.5的蛋白质点认为有差异。所有数据的统计分析均采用SPSS 12.0软件，统计学分析采用 t 检验。

　　1.6 基质辅助激光解吸电离-飞行时间质谱分析 用手术刀片切下胶上目标条带，进行切胶、胶上胰蛋白酶酶解 20 h ，抽提酶解肽段，Zip Tip脱盐后点样，行基质辅助激光解吸电离-飞行时间质谱（matrix assisted laser desorption/ionization time of flight mass spectrometry， MALDI-TOF-MS）分析（飞行管长2.7 m，加速电压 20 kV ，反射电压23 kV）。将第1级质谱得到的肽片段质量指纹图谱、肽质量指纹图谱与第2级质谱得到的肽序列信息一起用来检索蛋白质数据库，找出匹配的蛋白质。

　　1.7 数据库检索 将质谱鉴定所得的肽质量指纹谱（peptide mass fingerprinting， PMF）数据于Bio-Works（Thermo Finnigan， San Jose， CA）软件搜索相应的库。搜索使用的数据库为IPI human蛋白库（SEQUEST结果过滤参数为：当Charge+1，Xcorr≥1.9；当Charge+2，Xcorr≥2.2；当Charge+3，Xcorr≥3.75；其中DelCN≥0.1）以及NCBI上 Homo sapiens的非冗余蛋白库（redundant data-base）。检索参数为胰蛋白酶解；氨基酸固定修饰方式为脲甲基半胱氨酸；模式为单同位素峰；肽片断最大误差控制在100 ppm；肽片断最大分子量误差为±0.5 Da；每个肽允许有1个不完全裂解位点。

　　2 结果

　　2.1 脾肾虚型重症肌无力患者血清双向电泳图谱 的建立及分析 经2-DE技术及银染色后，得到了两组血清的双向凝胶电泳图，并于相同的条件下重复实验3次。在正常对照组细胞蛋白质组双向电泳图谱上可观察到1 463±179个蛋白点，而脾肾虚型重症肌无力组可见到1 508±89个蛋白点。见图 1～3 .

　　2.2 差异蛋白质点的鉴定和功能分析 通过对 2-DE 凝胶上差异表达的21个蛋白质斑点进行切割，用胰蛋白酶消化后进行MALDI-TOF-MS检测。 21个 点中获得了13张PMF（图4），另有8个蛋白质点未获得PMF.将查询到的结果再结合 2-DE 图谱上相应蛋白质的分子质量和PI值等进行综合分析，在获得的13张PMF数据中有5个无可信搜索结果。在数据库中匹配到符合结果要求的已知蛋白质有 8个 .本次检测的8个质点在脾肾虚型重症肌无力患者血清图谱中表达均增加，且差异都具有统计学意义。鉴定的8个质点分别为：载脂蛋白A-I（1382号及1438号质点）、白蛋白、胎球蛋白B的前体、载脂蛋白E的前体、转甲状腺蛋白前体、泰素耐药相关基因-3和前血清淀粉样蛋白P成分。这些蛋白分布广泛，并具有重要生物学功能。见表1 和2.

　　图1 正常人血清双向电泳图谱（略）

　　Figure 1 Two-dimensional electrophoresis map of normal persons‘ serum

　　图2 脾肾虚型重症肌无力患者血清双向电泳图谱（略）

　　Figure 2 Two-dimensional electrophoresis map of MG patients‘ serum

　　图3 正常人和脾肾虚型重症肌无力患者血清蛋白差异性比较局部放大图（略）

　　Figure 3 Augmented figure of differentially expressed proteins （comparison between MG group and normal group）

　　图4 772号样品肽指纹图谱（略）

　　Figure 4 Peptide mass fingerprinting of Sample 772

　　表1 通过MALDI-TOF-MS质谱IPI human蛋白库搜索情况列表（略）

　　Table 1 Differentially expressed proteins between MG patients and normal persons identified by2-DE and MALDI-TOF-MS or ESI-MS analysis of IPI human

　　表2 通过MALDI-TOF-MS质谱NCBI非冗余蛋白库搜索情况列表（略）

　　Table 2 Differentially expressed proteins between MG patients and normal persons identified by2-DE and MALDI-TOF-MS or ESI-MS analysis of NCBI

　　3 讨论

　　免疫功能调节异常是重症肌无力重要发病机制之一。现已证实，AchR-ab阻滞降解突触后膜受体，使自身抗原主要为烟碱型乙酰胆碱受体活性降低，突触后膜表面积减少，神经-肌肉接头传递障碍，出现肌无力症状，T细胞在该免疫应答过程中起关键作用［2，3］。90%以上病人血清中可检出AchR-ab［4］。AchR-ab已成为最重要的MG实验室诊断检测指标。该疾病与遗传也有密切关系。重症肌无力需要长期治疗，且药物毒副作用大［5］。重症肌无力属中医“瘘证”范畴，是以眼睑下垂，四肢软弱无力，晨轻暮重，渐进性加重或伴有吞咽困难、构音不清为特征的疾病。其根本病机是脾肾亏虚。蛋白质组技术包括蛋白分离技术和鉴定技术，也即主要通过2-DE或二维液相色谱分析等蛋白质分离技术，建立蛋白质组图谱，并应用表面增强激光解吸电离或基质辅助的激光解吸离子化质谱技术，并结合飞行时间-质谱系统对结合的蛋白质或多肽进行质谱分析鉴定。双向电泳技术是蛋白质组研究的核心技术［6～8］。2-DE技术最大的优势在于它可以对细胞或组织内复杂的蛋白质组分进行整体性分析，从而可以分析不同生理和病理条件下蛋白质组的表达变化。本研究通过双向电泳技术，成功建立了脾肾虚型重症肌无力患者血清2-DE图谱。其中在正常对照组细胞蛋白质组双向电泳图谱上观察到了1 463±179个蛋白点，而重症肌无力组共观察到1 508±89个蛋白点。PMF是对蛋白酶解或降解后所得到的多肽片段质量图谱。对质谱分析所得肽片与多肽蛋白数据库中蛋白质的理论肽片进行比较，从而判别所测蛋白是已知还是未知，并在一定质量误差范围内记录每个蛋白质肽质量理论值与样品蛋白质肽质量测定值相符的数目，理论值与测定值相符数量最多的蛋白质即可能为需鉴定的样品蛋白质。由于不同的蛋白质具有不同的氨基酸序列，因而不同蛋白质所得肽片具有指纹的特征。应用肽质指纹数据进行数据库搜索是PMF分析蛋白质的最后一步，本研究所鉴定的21个点中共获得了13张肽质量指纹图谱，并在相应数据库中对蛋白进行了检索。本研究初步鉴定的蛋白质点中，在数据库中匹配到符合结果要求的已知蛋白质有8个。这8个点在重症肌无力患者血清图谱中表达均增加。具体而言，脾肾虚型重症肌无力患者载脂蛋白A-I、载脂蛋白E的前体蛋白、白蛋白、胎球蛋白B的前体、转甲状腺蛋白前体、泰素耐药相关基因-3和前血清淀粉样蛋白P成分均明显高于正常人。这些蛋白大都与物质代谢相关，能促进肌肉淀粉样变。1587号转甲状腺蛋白是含4个相同子单元的四聚体，在单体的情况下可形成淀粉样纤维，造成组织纤维化，并最终导致肌无力及肌萎缩；其主要在人体的肝脏中合成，通常形成致病的类淀粉沉积。其中1401号样品为前血清淀粉样蛋白P（pre-serum amyloid P， pre-SAP）成分。SAP是一种人类免疫系统的重要蛋白［9］，广泛存在于淀粉类物质中，被认为与慢性炎症和自身免疫疾病相关。与鉴定的958号样品匹配的为泰素耐药相关基因-3（taxol resistant associated gene-3， TRAG-3）。TRAG-3是Duan等［10］在寻找泰素耐药基因时发现的一个新的CT抗原，其编码的蛋白属于肿瘤/睾丸抗原家族成员。TRAG-3是一个与肿瘤相关的抗原，被作为一个免疫治疗的靶标。有研究发现，TRAG-3细胞毒性T淋巴细胞表位负载树突状细胞疫苗在体外能够有效激发抗瘤细胞毒性T淋巴细胞的免疫反应［11］。本研究提示，这些基因或蛋白质还可能与重症肌无力发病的免疫机制相关，但尚待进一步验证。重症肌无力是一与免疫相关的疾病，其发病的具体分子机制尚不十分明确。本研究通过双向电泳 及质谱分析技术，对照正常组，鉴定了8个差异表达蛋白，这为进一步研究该疾病的分子机制提供了基础。

　　4 致谢

　　感谢龙华医院科研实验室及中国科学院上海生命科学院蛋白质组研究分析中心。

　　【参考文献】

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　　4 Oda K， Shibasaki H. Myasthenia gravis： antibodies to extracellularly exposed antigenic determinants of acetyl-choline receptor. Neurology. 1986； 36（10）： 1374-1377.

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　　9 Ho JG， Kitov PI， Paszkiewicz E， et al. Ligand-assisted aggregation of proteins. Dimerization of serum amyloid P component by bivalent ligands. J Biol Chem. 2005； 280（36）： 31999-32008.

　　10 Duan Z， Feller AJ， Toh HC， et al. TRAG-3， a novel gene， isolated from a taxol-resistant ovarian carcinoma cell line. Gene. 1999； 229（1-2）： 75-81.

　　11 Zhu B， Chen ZT， Cheng XM， et al. In vitro induction of immune response by dendritic cells pulsed with TRAG-3-derived cytotoxic T lymphocyte epitope. Zhonghua Zhong Liu Za Zhi. 2004； 26（12）： 709-712. Chinese with abstract in English.朱波， 陈正堂， 程晓明， 等。 泰素耐药相关基因-3细胞毒性T淋巴细胞表位负载树突状细胞疫苗的体外免疫效应研究。 中华肿瘤杂志。 2004； 26（12）： 709-712.