【摘要】  目的 观察五氯酚钠对小鼠细胞免疫、体液免疫和巨噬细胞功能的毒性作用。方法 将五氯酚钠以25，50和100 mg/kg经灌胃方式一次给予小鼠，然后观察给药后3，24和48 h小鼠各项免疫功能的变化，采用T淋巴细胞增殖法测定细胞免疫功能，采用B淋巴细胞增殖法测定体液免疫功能，采用巨噬细胞吞噬能力和分泌NO的能力来测定巨噬细胞功能。结果 100 mg/kg五氯酚钠染毒后3 h，小鼠的脾脏和胸腺相对重量较对照组降低，脾脏B淋巴细胞的增殖能力受到抑制，腹腔巨噬细胞的吞噬功能和NO生成能力受到抑制。25和50 mg/kg五氯酚钠在染毒后24 h依然对脾细胞中B淋巴细胞增殖能力产生抑制作用。这种抑制效应到48 h时完全消失。结论 五氯酚钠一次染毒在25～100 mg/kg剂量范围内对小鼠体液免疫和细胞免疫功能产生抑制作用，100 mg/kg对巨噬细胞功能产生抑制作用，对细胞免疫功能未见影响。

　　【关键词】  五氯酚钠

　　五氯酚钠（又称灭钉螺药，PCP-Na）是在世界范围被广泛使用的一种农药，由于大面积推广，引起了一定的环境污染，对人类健康造成影响〔1，2〕。Lang等〔3〕利用人淋巴细胞在体外接触五氯酚研究中发现，无论工业品还是分析纯五氯酚在10～40μmol/L浓度下与淋巴细胞共同孵育8d，对于IgG和IgM抗体的产生量均有明显的抑制作用。Daniel等〔4〕在人群研究中发现，血液中五氯酚浓度的升高能够导致T细胞功能障碍。体外研究表明，5mg/L以上的五氯酚能够抑制克鲤鱼和港湾鱼的巨噬细胞和嗜酸性细胞杀菌活性〔5〕。目前的研究基本上以五氯酚为主，尽管五氯酚钠与五氯酚的代谢途径类似，但其毒性表现是否一致仍需要进一步探索。本研究采用五氯酚钠一次性染毒小鼠，观察染毒后不同时间小鼠免疫功能的变化。

　　1  材料与方法

　　11  实验动物  清洁级ICR雌性小鼠150只（北京大学医学部实验运动科学部）；体重20～24g，雌性，动物合格证号：SCXK（京）2002-0001.动物饲养室温，20～25℃，动物进食标准基础饲料，自由饮用自来水。

　　12  主要试剂  五氯酚钠（国产，分析纯，sodium pentachlorophenate）；四甲基偶氮噻唑蓝（MTT），刀豆蛋白A（ConA），脂多糖（LPS，美国Sigma公司）；RPMI1640完全培养液，Hanks液等。

　　13  动物染毒和处理  将小鼠随机分为4组，每组5只。分别为对照组（蒸馏水），25，50和100mg/kg组。将五氯酚钠一次性以灌胃方式染毒，分别在小鼠染毒后3，24和48h，处死小鼠，取出脏器，剔除结缔组织和脂肪，吸净残留血液，称重，进行各项指标测定。

　　14  T淋巴细胞增殖  处死小鼠，无菌取脾，制备成单个细胞悬液，然后将细胞数调整至2×106个/ml.将每份细胞悬液分2孔加入24孔板，每孔1ml，其中一孔作为对照，另一孔加入20μl ConA（400μg/ml）做为刺激孔，将细胞放入5%CO2，37℃培养箱中孵育68h，取出加入MTT（5mg/kg）50μl/孔，继续培养4h，弃上清，每孔加入1ml酸性异丙醇，吹打均匀，在酶标仪上570nm波长下比色。

　　15  淋巴细胞增殖  方法同T淋巴细胞增值，所用刺激物为25μl LPS（400μg/ml）。

　　16  巨噬细胞吞噬功能  处死小鼠后将RPMI 1640完全培养液2ml，注入小鼠腹腔，收集灌洗的液体，调整细胞数至５×１０４个/ml，将细胞悬液加入96孔培养板，每孔100μl.将巨噬细胞置入5%CO2，37℃培养箱中孵育2h，取出后弃上清，加入用RPMI 1640完全培养液稀释的中性红（50μg/ml）100μl，再置于5%CO2，37℃培养箱中孵育30min，取出96孔板，弃上清，每孔加入150μl冲洗液，冲洗后弃去。再加入100μl溶解液，在721分光光度计上540nm波长下比色。

　　17  巨噬细胞产生NO测定  巨细胞收集同巨噬细胞吞噬功能测定，收集细胞后，将细胞调整至１×１０６个/ml，加入24孔培养板，每孔1ml，放入5%CO2，37℃培养箱中孵育2h，取出后弃上清，每孔重新加入1ml RPMI 1640完全培养液，同时加入LPS（终浓度5μg/ml），继续培养24h，收集培养上清，用1ml培养上清与1ml Greiss试剂混匀，于540nm波长下比色。同时用亚硝酸钠配制标准曲线，计算培养上清中亚硝酸盐氮含量。

　　18  统计分析  采用SPSS统计软件进行单因素方差分析。

　　2  结果

　　21  一般状况

　　211  不同剂量的五氯酚钠一次染毒3 h对小鼠器官变化的影响（表1）  一次染毒3 h后，100 mg/kg五氯酚钠剂量组小鼠的脾脏和胸腺相对重量明显降低，与对照组比较差异有统计学意义，而肝脏和肾脏相对重量与对照组比较差异无统计学意义。50和25 mg/kg五氯酚钠剂量组小鼠脾脏、胸腺、肾脏和肝脏的相对重量与对照组比较差异无统计学意义。

　　表1  不同剂量组染毒3 h后小鼠器官重量变化（略）

　　注：相对重=脏器湿重（mg）/体重（g）；与对照组比较*P＜005；n=5

　　212  不同剂量染毒24h后小鼠器官变化25，50和100mg/kg五氯酚钠一次给予小鼠24h后，小鼠的脾脏、胸腺、肝脏和肾脏的相对重要与对照组比较，差异无统计学意义。

　　22  五氯酚钠毒对小鼠免疫功能的影响

　　221  五氯酚钠对小鼠T淋巴细胞增殖的影响  25，50和100mg/kg五氯酚钠染毒小鼠3，24和48h后，小鼠脾脏T淋巴细胞的增殖能力均未受到影响。

　　222  五氯酚钠对小鼠B淋巴细胞增殖的影响（表2）  25mg/kg剂量组染毒3h后，小鼠B淋巴细胞增殖能力受到抑制，抑制率为46%，随着时间延长，染毒后24和48h时这种抑制效应消失。50mg/kg剂量组染毒3h，也可见小鼠B淋巴细胞增殖能力受到抑制，抑制率为46%，随着时间延长，至染毒后24h，这种抑制效应依然存在，抑制程度减弱，抑制率为35%，进一步观察染毒后48h这种抑制效应消失。100mg/kg剂量组染毒3和24h，小鼠B淋巴细胞的增殖能力均受到抑制，抑制率分别为38%和40%，随着时间延长到染毒后48h，抑制效应消失。

　　表2  不同染毒剂量对小鼠脾脏B淋巴细胞增殖的影响（略）

　　注：与对照组比较*P＜005，**P＜001；n=5

　　223  五氯酚对小鼠巨噬细胞吞噬功能的影响（表3）  本研究发现，不同剂量五氯酚钠染毒组在3，24和48h时间点，只有100mg/kg组染毒3h后，小鼠腹腔巨噬细胞的吞噬功能受到抑制，而其他时间点和剂量均未见小鼠腹腔巨噬细胞吞功能受到抑制。

　　224  巨噬细胞产生NO的影响（表4）  由试验结果可见，在染毒所用的3个剂量中，只有100mg/kg五氯酚钠在给药3h后抑制了巨噬细胞分泌NO的能力，使得培养液中亚硝酸盐氮含量减少，其他时间点和剂量均未观察到巨噬细胞生成NO的能力受损。

　　表3  五氯酚钠对小鼠腹腔巨噬细胞吞噬功能的影响（略）

　　注：与对照组比较，** P＜001；n=5

　　表4  五氯酚钠对小鼠腹腔巨噬细胞分泌NO的影响（略）

　　注：与对照组比较，* P＜005；n=5

　　3  讨论

　　1000mg/kg五氯酚钠一次给小鼠3h后，脾脏和胸腺重量明显降低，小鼠的B淋巴细胞增殖和巨噬细胞吞噬及巨噬细胞分泌NO均受到抑制，表明五氯酚钠对免疫系统有抑制作用。而T淋巴细胞增殖未受影响，提示五氯酚钠对免疫系统产生有害作用时，有一定的选择性。五氯酚钠给药3h后，巨噬细胞100mg/kg组出现功能抑制，而脾脏B淋巴细胞增殖有25和50mg/kg就出现抑制，表明B淋巴细胞对五氯酚钠毒性敏感。五氯酚在哺乳动物细胞色素P450微料体混合功能氧化酶参与代谢，转化形成四氯氢醌（TCHQ）和四氯儿茶酚（Ｃ１４ＣＡＴ）〔6-8〕。四氯氢醌对免疫细胞有损伤作用，但是五氯酚在体内转化成四氯氢醌需要一定的时间。五氯酚（PC）在肝组织中经过代谢，产生的未结合四氯氢醌于摄入PCP后4h达到高峰，其后下降排出〔１１〕，则达到脏器（脾脏，腹腔）的时间必然还要延迟。给予B6C3F雄性小鼠300mg/（kg.d）的四氯氢醌2周后肝细胞核DNA的8OHdG比对照组明显增多，但是一次注射20或者50mg/kg的四氯氢在6和24h均未发现8OHdG的含量增加〔9〕，提示四氯氢醌在体内的作用需较长时间。因此，在本研究中，染毒3h后观察到的免疫细胞功能的变化，可能是五氯酚钠本身的直接作用。

　　【参考文献】〔1〕 Seiler JP.Pentacholorophenal［J］。Mutation Research，1991，257：27-43.

　　〔2〕 王晓红，钱松，杨润，等。人体五氯酚环境接触量的研究［J］。环境与健康杂志，1998，15（1）：24-26.

　　〔3〕 Lang D，Mueller-Ruchholta W.Human lymphocyte reactivity after in vitro exposure to technical and analytical grade pentachaloropheno［J］。Toxicology，1991，70：271-282.

　　〔4〕 Daniel V，Huber W，Bauer K，et al.Impaired in vitro lymphocyte responses in patients with elevated pentacholorophenol blood levels［J］。Archives of Environmental Health，1995，50（4）：287-292.

　　〔5〕 Roszell LE，Anderson RS.Hydrogen peroxide production and bactericidal activity in pronephros phagocyte sub-populations from fundulusheteroclitus following exposure to pentachloropheno［J］。Pollution and Environmental Issues，1997，44（1）：69.

　　〔6〕 Bain LJ.LeBlanc GA.Mobilization of pantachlorohenol by glutathione S-transferase increases cellular toxicity［J］。Pesticide Biochemistry and Physiology，1996，54：65-72.

　　〔7〕 Lin PH，Waidyanatha S，Pollack GM，et al.Dosimetry of chlorinated quinone metabolites of pentachlorophenol in the livers of rats and mice based upon measurement of protein adducts［J］。Toxicology and Applied Pharmacology，1997，145：339-408.

　　〔8〕 Mehmood Z，williamson MP，Kelly DE，et al.Metabolism of organchlorine pesticides：the role of　human cytochrome P450 3A4［J］。Chemosphere，1996，33（4）：759-769.

　　〔9〕 Dahlhaus M，Almstadt E，Appel KE.The pentachlorophenol metabolite tetrahloro-p-hydroquinone induces the formation of 8-hydroxy-2 deoxyguanosine in liver DNA of male B6C3F1 mice［J］。Toxicology Letters，1994，74（3）：265-274.