骨髓基质细胞治疗缺血性脑血管病的研究进展

2007-07-24 14:16 来源：

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　　1992年Reynolds等［1］首次从成年鼠纹状体中分离出神经干细胞，从而打破了神经损伤不可修复的观点，有关神经干细胞的研究已成为当今神经科学领域的热点。神经干细胞和胚胎干细胞移植曾一度为缺血性脑损伤的治疗开辟了一条新的途径，但由于两者来源主要有克隆和胚胎两个方面，方法复杂，涉及伦理问题，临床应用受限。最近，骨髓基质细胞（BMSC）横向分化现象的发现以及其易获得性又使人们对干细胞移植在脑血管病方面的治疗前景充满信心。现就近年来有关BMSC治疗缺血性脑血管病的基础与临床研究综述如下。

　　1 BMSC的生物学特点

　　Friedenstein等［2］首先从骨髓中分离到BMSC，他们将整个骨髓放置于塑料培养皿中，在去除非贴壁细胞后，观察到呈纺锤状的贴壁细胞，并形成2~4个细胞的小灶，最初量少，呈集落生长，数天后开始迅速分裂，大量增殖呈片状融合，经传代培养后这些细胞成为均一的梭形，这些细胞集落成BMSC.BMSC可随外周微环境的变化而分化为多种间充质组织，如骨、软骨、脂肪、肌肉、肌腱及纤维组织等［3］。最近研究［4］发现BMSC除了分化为间充质细胞谱系外，还具有向非间充质细胞谱系如肝细胞、心肌细胞及神经细胞分化的多向分化潜能。BMSC在骨髓中含量较少，并且随着年龄增长递减。采用免疫组化染色及流式细胞仪研究表明BMSC表达多种表面抗原标志如SH2、SH3、CD29、CD44、CD71、CD90、CD106、CD120a和CD124等［3］，而不表达造血系统特征性标志CD31、CD34、 CD45、CD117和CD133，证明BMSC与造血系统不是一类细胞［5］。迄今尚未找到BMSC特异性抗原标记，鉴定BMSC目前主要依赖其形态水平，比较公认的相对特异性的BMSC抗原标记物是CD90、CD71及CD44.BMSC具有干细胞的特点，即增殖、分化和自我更新的能力，取材方便、扩增迅速、易体外培养；可取材于自身，不产生免疫排斥反应，也无伦理道德问题。将表达绿色荧光蛋白的BMSC经静脉注入小鼠后可以通过血脑屏障，迁移到脑实质不同区域并表达小胶质细胞标志物iba1，为BMSC移植应用于脑缺血性疾病的治疗提供了可能［6］。

　　2 BMSC治疗缺血性脑损伤的动物实验研究

　　BMSC移植对脑缺血性疾病的治疗作用在不同的实验研究中得到证实。Li等［7］将人BMSC经尾静脉移植给缺血1 d的短暂性大脑中动脉闭塞（MCAO）模型大鼠，结果人BMSC并未诱导大鼠产生明显的免疫排斥反应，移植后第14 d，与对照组（未给予BMSC或给予大鼠肝结缔组织细胞移植）相比，静脉移植人BMSC大鼠的神经功能显著改善，移植的BMSC中有1%～5%表达神经细胞特异性抗原标记；采用ELISA方法分析发现脑组织中脑源性神经营养因子（BDNF）和神经生长因子（NGF）显著增加；用TUNEL染色可见缺血边缘区凋亡细胞数减少，缺血大脑半球脑室下区BrdU （5溴尿嘧啶）阳性细胞显著增加。BMSC对MCAO大鼠发挥治疗作用是通过多种机制来实现的，主要包括缺血区神经营养因子（NTF）分泌增加、缺血半暗带凋亡细胞减少和脑室下区内源性神经干细胞增殖等。Shen等［8］将雄性大鼠来源的BMSC静脉移植给缺血1个月的短暂性MCAO雌性大鼠，移植后3个月处死，与未治疗的对照组相比，BMSC组改良神经功能评分显著改善，原位杂交显示BMSC主要存活于缺血同侧大脑半球，Y染色体阳性的细胞中13%表达胶质纤维酸性蛋白（GFAP）（星形胶质细胞的标志物），6%表达微管相关蛋白2（MAP2）（神经元的标志物）。Chen等［9］对MCAO大鼠模型在大脑中动脉闭塞24 h及7 d后尾静脉移植BrdU标记的BMSC，分别于14 d和35 d后处死，结果观察到BMSC治疗组大鼠的运动、感觉及平衡能力获得显著改善；BMSC可在缺血大脑半球存活及集聚，部分细胞表达神经细胞标志性蛋白如MAP2、NeuN、GFAP等。Kurozumi等［10］将BDNF 基因修饰的BMSC植入MCAO的Wistar大鼠模型，在术后第7 d和第14 d MRI扫描发现脑梗死体积比对照组显著缩小，神经功能的缺损明显改善。

　　3 BMSC治疗脑外缺血性病变的临床研究

　　BMSC对脑外缺血性病变的研究主要在动物模型上进行，其对缺血性脑损伤的临床研究目前鲜见。但已有学者开展了BMSC对周围血管病及缺血性心脏病的临床研究。Kim等［11］采用自体BMSC移植治疗血栓闭塞性脉管炎，结果发现大部分患者患肢侧支循环血管增生，血液供应增加，肢体功能获得明显改善。TateishiYuyama等［12］通过对周围血管病变患者患肢腓肠肌注射BMSC，肯定了自体移植BMSC的有效性和安全性，并指出自体移植的BMSC能向内皮祖细胞分化并分泌一些促进血管生成的细胞因子。Tse等［13］对8例严重的缺血性心脏病患者经皮导管心肌内植入自体BMSC，3个月后患者临床症状明显缓解，缺血区域血流灌注和功能得到改善。

　　4 BMSC治疗脑缺血性疾病的作用机制

　　4.1 BMSC的分化 BMSC可分化为神经细胞、替代损伤细胞、重建神经环路，从而达到恢复神经功能的目的。BMSC含有一些多分化潜能的间充质祖细胞，在一定条件下可诱导分化为神经元样细胞。使用BMSC修复神经组织、促进神经功能恢复关键在于诱导其向神经细胞分化。已有众多学者报道BMSC在体内外可分化成为神经元和神经胶质细胞。

　　4.1.1 体内分化成为神经细胞有研究［14］显示脑梗死区特殊的微环境有利于BDNF、GDNF、NGF等NTF的表达，这些NTF不但是内源性干细胞分化信号分子，也是BMSC分化成神经细胞所必需的。Lu 等［15］报道将BrdU标记的BMSC通过颈内动脉注入外伤性脑损伤大鼠模型，细胞治疗7 d后采用免疫组化检查发现BMSC可通过血脑屏障向病变部位迁移，并对微环境中的一些信号作出反应，表达MAP2、NeuN和GFAP等神经细胞的标志性抗原蛋白。冯大雄等［16］对脊髓损伤7 d动物模型静脉移植BMSC，移植后2周，BMSC形态大多变为圆形或椭圆形，约126%表达星形胶质细胞特异性蛋白GFAP，约5.4%表达神经元特异性核蛋白（NeuN）。

　　4.1.2 体外分化成为神经细胞诱导BMSC在体外分化成为神经细胞，目前采用的方法有两种，即用抗氧化剂［17］和NTF ［18］。Woodbury等［17］报道抗氧化剂能迅速诱导BMSC分化成神经细胞，将成年大鼠和人的BMSC先在含β巯基乙醇的培养基中培养24 h，随后在含丁羟基苯甲醚、二甲亚砜的培养基中培养，60 min内BMSC即有神经元形态学的改变，1周之内，超过50%的BMSC出现神经元形态学的改变，并表达神经元标记物神经元特异性烯醇化酶（NSE）、NeuN 、NFM或tau.尽管抗氧化剂诱导效率高、起效快，但却具有细胞毒性作用，出现细胞皱缩，细胞骨架改变［4］。SanchezRamos等［18］发现BMSC在含有表皮生长因子（EGF）或BDNF的培养体系诱导7～14 d，发现有神经前体细胞标记物nestin及神经元和胶质细胞标记物NeuN、GFAP的表达；BMSC与中脑或纹状体细胞共同培养后部分细胞也会分化成为神经元样细胞表达NeuN和GFAP.Gao 等［19］研究发现BMSC可被诱导分化成肠道神经元并表达肠道的神经递质，产生GDNF 及NGF，故提出BMSC 可作为一种新的方法治疗神经性胃肠蠕动失调症。

　　4.2 NTF的作用脑缺血可引起NTF的分泌增加［20］，而BMSC 的植入会明显提高多种NTF的分泌。研究［21］发现BMSC可分泌NTF，如BDNF、NGF、血管内皮生长因子（VEGF）和肝细胞生长因子（HGF）等。Chen等［21］将人BMSC培养在含有鼠脑抽提物的培养基中，采用ELISA方法发现BDNF、NGF、VEGF、HGF分泌呈时间依赖性增加，这些NTF能产生神经保护作用和支持新生血管形成。在脑缺血后移植进入脑内的BMSC释放这些NTF对脑卒中动物功能的恢复具有重要作用，从而达到治疗目的。NTF又产生有利于BMSC自身存活、分化的微环境，可以促进BMSC向神经元分化。这就提示BMSC可能通过自分泌或者旁分泌NTF以及与外源性NTF协同发挥神经保护作用。

　　4.3 促进血管生成、改善局部血液供应血管新生与功能恢复有关，因为血管形成是正常组织修复中不可缺少的过程。缺血本身可以促进血管新生［5］，但是仅仅依靠自身有限的血管新生还不足以使受损的缺血组织恢复血液供应以达到功能恢复的需要。王春雪等［22］采用重组人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子（ rhGMCSF）在体外诱导BMSC分化为内皮细胞，并将诱导分化后的内皮细胞静脉移植MCAO大鼠模型后，大鼠神经功能得到改善，同时观察到VEGF及其受体的表达上调。Chen等［23］将人BMSC静脉移植入脑缺血大鼠模型，发现其可促进大鼠缺血周边区域新生血管生成，同时VEGF的分泌和VEGF receptor2的表达增加，提示BMSC可能通过促进新生血管生成改善神经功能。

　　4.4 刺激内源性神经干细胞的增殖分化在有损伤的局部环境信号变化的刺激下，内源性神经干细胞会代偿性增殖、分化。曾有学者尝试在神经系统损伤局部应用某些激活因子，以激活存在于损伤局部的神经干细胞，诱导其增殖、分化、整合，从而完成对损伤或变性的修复。Fallon等［24］已观察到在动物脑内应用转化生长因子α（TGFα）可迅速促进神经干细胞增殖并向注射TGFα的局部迁移，随后分化为成熟的神经细胞。但刺激自身神经干细胞的增殖较神经干细胞移植更为困难，因为神经干细胞的增殖和定向分化需要多种生长因子协同作用，通过一系列信号转导途经来实现。BMSC移植可能为缺血损伤的脑组织提供一些促分化因子，促进宿主脑组织内源性神经干细胞的增殖、迁移、分化和成熟，生成新的神经元和胶质细胞，修复受损脑组织，促进神经功能的改善［7］。

　　4.5 抗凋亡作用脑缺血损伤发生后，缺血中央区神经元坏死，而周边区则发生迟发性神经元凋亡。如何能及时挽救缺血周边区即半暗带的细胞，改善局部血供，减少细胞的凋亡，是减轻脑缺血损伤的最终目标。Li等［7］将人BMSC经尾静脉移植给MCAO大鼠，与对照组相比神经功能缺损得到明显改善，采用TUNEL和HE染色可见缺血边缘区凋亡细胞数减少。Kurozumi等［10］将BDNF 基因修饰的BMSC植入MCAO的Wistar大鼠模型，免疫组织化学检查发现缺血周边区域凋亡细胞显著少于对照组。上述研究说明BMSC移植治疗脑缺血损伤能减少细胞的凋亡，但其具体作用机制尚不清楚。

　　5 展望

　　BMSC具有多能干细胞的特点，可向多个方向分化，取材方便，而且植入体内能保持细胞活性，被认为是理想的组织工程种子细胞［3］。因此，可作为神经系统疾病的细胞基因工程治疗的有良好发展前景的载体。虽然对BMSC的研究取得了令人瞩目的成果，但目前大部分仅停留在动物实验阶段，真正进入临床应用还存在很多困难需要克服，如BMSC移植入脑内的最佳方式，患者能否接受；BMSC移植治疗的时机和剂量；是什么信号诱导BMSC到达缺血损伤区；BMSC在脑内分化为神经细胞的机制；细胞移植后能否整合入宿主的神经环路；这些问题均有待于进一步的研究。

　　基金项目：江苏省卫生厅“135工程”重点人才基金资助

　　【参考文献】［1］Reynolds BA，Weiss S.Science，1992，255： 1707

　　［2］Friedenstein AJ，Gorskaja JF，Kulagina NN.Exp Haematol，1976，4：267

　　［3］Pittenger MF，Mackay AM，Beck SC，et al.Science，1999，84：143

　　［4］Lu P，Blesch A，Tuszynski MH.J Neurosci Res，2004，77： 174

　　［5］Kinnaird T，Stabile E，Burnett MS，et al.Circ Res，2004，95： 354

　　［6］Simard AR，Rivest S.FASEB J，2004，18： 998

　　［7］Li Y，Chen J，Chen XG，et al.Neurology，2002，59：514

　　［8］Shen LH，Li Y，Chen J，et al.J Cereb Blood Flow Metab，2006，26：1038

　　［9］Chen J，Li Y，Wang L，et al.Stroke，2001，32：1005

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