【摘要】  目的：探讨糖皮质激素治疗婴幼儿血管瘤的机理。 方法：对50例不同组别血管瘤（治疗显效组18例，无效组17例，未治疗组15例）及16例正常皮肤标本进行：①凋亡研究：光镜及透射电镜下观察组织形态学变化；TUNEL法检测血管内皮细胞（VEC）的凋亡水平；IHC法检测凋亡调控基因bcl2， cmyc的表达；②增殖水平研究：IHC法检测PCNA. 结果：①组织形态学变化：光镜下各组均无明显炎症及坏死征象，透射电镜观察显效组有较多VEC凋亡征象。 ②VEC增殖及凋亡：显效组VEC的凋亡水平显著高于无效组、未治疗组及正常皮肤组（TUNEL： 47.86±3.14， 22.05±3.93， 19.20±2.82， 35.51±3.81， P<0.01）， 而增殖水平明显低于上述三组（PCNA： 10.25±3.89， 44.33±5.01， 56.32±4.12， 17.91±3.76， P<0.01）。 ③凋亡调控情况：显效组bcl2表达显著低于无效组和未治疗组（21.28±4.70， 49.96±5.33， 52.51±7.69， P<0.01）；cmyc表达也明显低于后两组（25.20±5.01， 51.81±5.68， 56.28±6.92， P<0.01）。 结论：① 糖皮质激素可能通过诱导VEC凋亡及抑制其增殖而促进血管瘤消退。 ② 糖皮质激素对VEC凋亡的影响可能与其下调bcl2和cmyc的表达水平有关。

　　【关键词】  血管瘤， 血管内皮细胞；糖皮质激素；增殖， 凋亡

　　0引言

　　血管瘤（不包括血管畸形）是小儿最常见的肿瘤，绝大多数为良性［1］。 糖皮质激素治疗是目前公认的首选方法［2-3］。 但其治疗机理目前并不十分清楚，且在临床上，仍有部分血管瘤疗效不明显。 本文通过检测血管瘤血管内皮细胞（vascular endothelia cell，VEC）的增殖、凋亡以及凋亡调控指标，结合光镜及电镜下组织形态学变化，初步探讨激素治疗血管瘤的机理，为提高临床疗效提供思路。

　　1材料和方法

　　1.1材料

　　199906/200405手术切除的草莓状血管瘤标本50例及正常皮肤标本16例，血管瘤标本取自4月到2岁患者，其中未治疗组15例，治疗显效组18例，无效组17例，男女比例为1∶2. 原位细胞凋亡检测试剂盒（宝灵曼公司）；鼠抗人PCNA单克隆抗体（福州迈新生物技术开发公司）；cmyc及bcl2试剂盒（福州迈新公司）；SP试剂盒（北京中山生物技术有限公司）。

　　1.2方法

　　1.2.1免疫组化染色用过氧化物酶抗过氧化物酶法检测

　　VEC的增殖细胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen，PCNA）水平及cmyc和bcl2的表达水平。 PCNA，cmyc以胞核染色棕色者为阳性，而bcl2以胞浆中见棕色颗粒者为阳性。 光镜400倍下不同视野随机观察300个VEC，计阳性细胞数，然后计算每100个细胞中阳性细胞数，记为阳性表达率（positive rate）。

　　1.2.2凋亡细胞的原位检测

　　采用末端脱氧核糖核苷酸转移酶介导的带荧光的dUTP缺口末端标记法（TdTmediated dUTP nick end labeling， TUENL），原位标记凋亡细胞核中的DNA片段3′OH末端，显示未治疗组、治疗显效组和治疗无效组及正常对照组VEC的凋亡。 检测方法按宝灵曼公司试剂盒说明书进行，以PBS代替生物素化的dUTP作为阴性对照。 光镜400倍下不同视野随机观察300个VEC，均以胞核染色棕色者为阳性，计阳性细胞数，然后计算每100个细胞中阳性细胞数，即凋亡指数。

　　1.2.3光镜下组织形态学标本进行常规H.E染色后，光学显微镜下观察其组织学特点、VEC增殖情况及血管壁结构完整性。

　　1.2.4透射电镜观察显效组1例（6 mo，女）细胞超微结构变化常规无菌术切除血管瘤瘤体，修去脂肪组织后切成小块，用2.5 g/L戊二醛固定，按常规方法制备半薄切片、超薄切片，H600型透射电子显微镜观察、摄片。 取同龄小儿择期手术中所弃正常皮肤作为对照。

　　统计学处理：计量资料用x±s表示，组间均数比较经SAS统计软件进行方差分析和q检验，P<0.01为有统计学意义。

　　2结果

　　2.1光镜下组织形态学与正常皮肤组相比，显效组18例血管瘤在镜下以脂肪组织及少量纤维组织为主，VEC无明显增殖现象，未见明显淋巴细胞浸润、血管壁塌陷、管腔堵塞及VEC脱落等组织结构破坏征象；未治疗组15例以及无效组17例在镜下以大量增生的血管为主，VEC增殖活跃，未见前述组织结构破坏征象（图1A~D）。

　　2.2透射电子显微镜观察与正常皮肤组织相比，显效组血管瘤组织中许多VEC呈典型的凋亡形态变化，染色质固缩聚于核膜下，境界分明，有完整的核膜包绕，细胞浆浓缩，可见线粒体轻度肿胀等而基本未见到明显的VEC坏死征象（图2A~D）。

　　A： 正常皮肤； B： 显效组血管瘤中凋亡的血管内皮细胞。

　　2.3VEC增殖及凋亡情况于光学显微镜下按上述标准计数，结果显示显效组VEC的凋亡水平高于无效组、未治疗组及正常皮肤组（P<0.01），而增殖水平低于上述三组（P<0.01）。 bcl2：无效组和未治疗组间无统计学差异， 其余各组间均有统计学差异。 cmyc：无效组和未治疗组，显效组和正常皮肤组间无统计学差异，余各组间有统计学差异（表1）。表1VEC凋亡指数及各指标阳性表达指数（略）

　　3讨论

　　血管瘤是小儿最常见的肿瘤，多数能自然、缓慢地消退。 但某些生长在颜面、颈部等特殊部位或增长特别迅速者可影响正常器官功能或引起溃疡、出血和疼痛等并发症，需积极治疗。 临床上使用糖皮质激素治疗血管瘤已有多年，主要有强的松口服或缩丙酮确炎舒松及倍他米松［2］瘤体内注射等途径。 和激光、冷冻、同位素敷帖及硬化剂注射等方法相比，激素治疗具有在早期无局部红、肿等炎症表现，后期血管瘤消退后不残留疤痕，亦无色素沉着等优点，这一点与血管瘤自然消退过程颇为类似。 近年研究显示，VEC增殖—凋亡平衡的变化可能在这一自然过程中起着重要作用：增生期VEC增殖水平高于凋亡，血管瘤快速增长；随年龄增长，VEC增殖水平渐下降而凋亡水平上升，VEC堆积逐渐减少，血管瘤缓慢消退［4-7］。 此外，有研究发现糖皮质激素可诱导胸腺细胞、B淋巴细胞等发生凋亡［8］，提示其诱导VEC凋亡的可能性存在。 据此推测，糖皮质激素也可能通过诱导VEC凋亡从而促进血管瘤“自然”地消退。 我们在实验中进行了VEC凋亡和增殖方面的研究。 首先，检测了各组标本的TUNEL水平和PCNA表达水平。 TUNEL是检测细胞凋亡的一种敏感性和特异性均较高的方法，而PCNA是反映细胞增殖情况的良好指标。 结果显示，显效组血管瘤VEC的TUNEL水平显著高于未治疗组、无效组及正常皮肤组，而PCNA水平低于上述三组，即显效组的凋亡水平高而增殖水平低，提示糖皮质激素注射治疗能促进VEC凋亡同时抑制其增殖，从而促使血管瘤消退。

　　在组织形态学观察中，光镜下发现显效组18例VEC明显减少，且增殖不活跃，代之为脂肪组织及少量纤维组织，未见明显淋巴细胞浸润、血管壁塌陷及VEC脱落等炎症及坏死征象；透射电镜下可见较多凋亡VEC，而基本未见VEC坏死征象。 从而进一步证实，糖皮质激素治疗后血管瘤的萎缩缘于大量的VEC发生了凋亡而非坏死［9］，所以不伴炎症及疤痕增生、色素沉着等并发症。

　　为探讨激素对VEC凋亡的影响，本实验中还检测了常见的凋亡调控基因bcl2及cmyc在各组中的表达。 本实验数据显示，与其高凋亡率恰好相反，显效组血管瘤VEC的bcl2表达水平明显低于其他各组，提示糖皮质激素对血管瘤VEC凋亡的诱导作用可能与bcl2表达水平下调，对凋亡的抑制作用减弱有关。 在我们的实验中，显效组血管瘤VEC的cmyc表达水平明显低于其他三组，与bcl2变化趋势相似，提示cmyc在VEC中可能也起着抑制凋亡的作用，且这一作用可能因受到糖皮质激素的下调而减弱。 综上所述，糖皮质激素可能通过下调血管瘤VEC的bcl2及cmyc的表达，诱导VEC凋亡，从而促进血管瘤消退。 这种下调的具体机制目前尚不明确，有待进一步研究。

　　我们发现糖皮质激素可能通过某些调节机制下调血管瘤VEC bcl2和cmyc的表达，使VEC凋亡增加而增殖受到抑制，从而促进血管瘤消退，而对此调节的失败可能是治疗无效的原因之一。 对于这部分病例，能否找到一种有效地下调其bcl2及cmyc表达的方法，如利用反义核酸特异性地阻断其表达，从而提高糖皮质激素治疗的疗效，有待进一步探讨。

　　【参考文献】［1］Sarafian V， Dikov D， Kara ivanov M， et al. Differential expression of ABH histoblood group antigens and LAMPs in infantile hemangioma［J］。 J Mol Histol， 2005， 36（89）：455-460.

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