【摘要】  目的：探讨脉冲电磁场（PEMFs）对大鼠骨髓间充质干细胞（rMSCs）的影响。 方法：用全骨髓贴壁法分离rMSCs，对其进行1 Hz和15 Hz的PEMFs刺激，MTT法测定细胞增殖水平，检测碱性磷酸酶活性，进行四环素荧光染色和钙结节染色。 结果：rMSCs经PEMFs刺激后，各实验组细胞增殖水平均有不同程度提高，差异具有统计学意义（P<0.05），其中1 Hz，0.4 mT组改变最为明显（3 d，0.323±0.051；5 d，0.714±0.058），对照组（3 d，0.246±0.044；5 d，0.487±0.064），差异具有统计学意义（P<0.01）；碱性磷酸酶检测实验组水平升高（5 d，0.348±0.032；15 d，2.339±0.034），对照组（5 d， 0.205±0.026；15 d，0.533±0.013），差异具有统计学意义（P<0.05）， 四环素荧光染色和钙结节染色结果均呈阳性。 结论：rMSCs经PEMFs刺激后，能促进体外培养rMSCs的增殖水平及成骨分化，磁场参数对实验结果有影响。

　　【关键词】  脉冲电磁场；骨髓间充质干细胞；增殖；成骨细胞

　　0引言

　　骨髓间充质干细胞（mesenchymal stem cells，MSCs）存在于骨髓基质系统中，具有自我更新能力和多向分化潜能，免疫原性弱［1-3］。 脉冲电磁场（pulsed electromagnetic fields，PEMFs） 能够促进活细胞增殖及分化，刺激骨局部因子的产生，改善骨密度和生物力学特性［4］，用于骨折延迟愈合、骨不连、骨质疏松症等骨科疾病［5］。 近年来，国内学者在这方面开始了大量研究工作，认为MSCs经12 Hz，1.1 mT的PEMFs合理刺激后，细胞增殖加速，符合成骨细胞的形态特征和生物学特性［6］。 利用恒磁场作用于骨组织中细胞，发现恒磁场处理可以促进MSCs向成骨方向分化［7］。 本实验通过观察rMSCs在低频率PEMFs的作用下增殖水平变化和细胞分化情况，以了解不同参数的PEMFs对rMSCs产生的影响。

　　1材料和方法

　　1.1材料

　　SD仔鼠，12～15 d，体质量30～35 g，第四军医大学实验动物中心提供。 骨愈合刺激仪（第四军医大学生物医学工程系研制，ZL.0224739.4），治疗频率为15 Hz和1 Hz. 低糖DMEM（美国Hyclone公司）；胎牛血清（天津灏洋生物制品科技有限责任公司）；胰蛋白酶，茜素红S（美国Sigma公司）；盐酸四环素胶囊（西安利君制药股份有限公司）；碱性磷酸酶试剂盒（中生北控生物科技股份有限公司）。

　　1.2方法

　　1.2.1rMSC的体外分离培养

　　断颈处死大鼠，无菌条件下取其股骨和肱骨。 在PBS中将骨剪成1～2 mm3的小块，100目筛网过滤后移入离心管中，1200 rpm离心5 min，弃上清，重悬浮于4 mL低糖DMEM中。 72 h后换液。

　　1.2.2rMSCs生物学特性鉴定

　　进行PAS过碘酸雪夫氏染色、油红O染色和碱性磷酸酶（ALP）染色。

　　1.2.3rMSCs生长曲线的绘制

　　将原代细胞以5×106 cells/孔接种在24孔板上，第4日开始，每日消化3个孔，分别计数，求平均值绘制生长曲线。 将第3代细胞以1×104 cells/孔接种在24孔板上，第2日开始以同上方法绘制生长曲线。

　　1.2.4刺激方法

　　PEMFs发生仪频率：15 Hz，1 Hz；磁感应强度：0～0.8 mT可调；线圈直径：200 mm. 调整两线圈距离至100 mm. 将线圈放置在孵箱中，刺激时将细胞放置在两线圈中间位置。 调整需要的强度和频率，刺激结束后，将对照组放在同样位置相同时间。 刺激时间为每次3 h，1次/d.

　　1.2.5MTT法检测

　　细胞增殖将rMSCs以1×104 cells/mL接种于7个96孔板中，每板接种32孔。 刺激方式为：T0组（对照组）；T1组（15 Hz，0.2 mT）；T2组（15 Hz，0.4 mT）；T3组（15 Hz，0.8 mT）；T4组（1 Hz，0.2 mT）；T5组（1 Hz，0.4 mT）；T6组（1 Hz，0.8 mT），连续作用5 d. 接种第2日开始PEMFs作用。 第3日每板选择16孔，加MTT（5 g/L）20 μL，37℃孵育4 h，弃上清，加入DMSO 150 μL，振荡10 min，测定490 nm波长时各孔的吸光度A值。 第5日对其余孔做同样检测。

　　1.2.6ALP活性检测

　　将rMSCs以每孔1×104 cells/mL接种于6个24孔板中，每板接种8孔，分为2组，每组3个板。 刺激方式为：T0组（对照组），T1组（1 Hz，0.4 mT）。 接种第2日开始PEMFs刺激，连续刺激15 d. 第3日选两个板，测定ALP活性。 第5日和第15日各检测2个板。

　　1.2.7四环素荧光标记

　　将rMSCs以3×104 cells/mL接种于2个6孔板中，分为对照组与实验组。 第2日开始对实验组进行PEMFs刺激，每天刺激结束后，关闭仪器电源，将对照组放在相同位置相同时间。 培养18 d后对细胞进行四环素荧光标记。 荧光显微镜下观察并采集图像。

　　1.2.8钙结节染色

　　将rMSCs以5×104 cells/mL接种于2个6孔板中，分为对照组与实验组。 接种第2日开始PEMFs作用，对照组处理同前。 28 d后，用茜素红S染液进行钙结节染色。 倒置显微镜下观察并采集图像。

　　统计学处理：数据以x±s表示，应用SPSS 12.0统计软件进行分析，采用SNKq检验和方差分析。 以P<0.05为有统计学意义。

　　2结果

　　2.1形态学观察及生物学鉴定

　　接种前3 d可见大量大小不一，圆形悬浮细胞。 第5日大部分细胞呈成纤维细胞样，第7日后，可见梭形细胞，部分形成集落，排列呈规则的辐射状。 经2～3次纯化处理，细胞形态趋于单一化，以梭形、三角形为主，呈集落生长趋势（图1）。 染色结果均为阴性，说明细胞不能分泌糖原、未向脂肪细胞及成骨细胞分化。

　　2.2rMSCs生长曲线的绘制

　　细胞生长曲线呈“S”形，具有稳定的潜伏期、对数增长期和平台期。 可见传代细胞生长周期明显比原代细胞短（图2）。

　　2.3PEMFs对rMSCs增殖水平的影响

　　PEMFs刺激3 d后，T1，T2，T4与对照组A值分别为0.265±0.063，0.260±0.059，0.266±0.057和0.246±0.044，组间差异均无统计学意义（P>0.05）。 T3，T5和T6组A值分别为0.288±0.060，0.323±0.051和0.300±0.042，与对照组相比差异均具有统计学意义（P<0.05），以T5最为明显。 PEMFs刺激5 d后，各实验组和对照组组间差异均具有统计学意义（P<0.05），T5，T6和对照组A值分别为0.714±0.058， 0.720±0.069和0.487±0.064，组间差异比较均具有统计学意义（P<0.01）。

　　2.4ALP活性检测经

　　PEMFs刺激后，实验组与对照组A值3 d为0.225±0.017和0.185±0.025，差异无统计学意义（P>0.05）；5 d为0.348±0.032和0.205±0.026，差异具有统计学意义（P<0.05）；15 d为2.339±0.034和0.533±0.013，差异具有统计学意义（P<0.01）。

　　2.5四环素荧光标记

　　细胞8 d左右呈梭形分布，并出现融合，约16 d左右出现结节状物。 继续培养可见复层生长。 持续培养，中心出现圆形细胞结节。 培养21 d时，尚无明显钙结节出现。 但四环素荧光标记后，镜下细胞周围基质聚集区呈明亮的黄色荧光区，阳性面积约占（10.1±1.2）%；对照组阳性面积约占（2.3±0.7）%. 两者之间差异具有统计学意义（P<0.01，图3）。

　　2.6钙结节染色结果

　　持续培养32 d后进行钙结节染色，可见钙结节成橘红色，大小、形态各不相同，边界清晰，呈火山状突起，中间有黑色不透光颗粒，周围为橘红色，由中间向周边颜色逐渐变浅，阳性面积约占（15.3±0.6）%；对照组阳性面积约占（9.6±0.8）%. 两者之间有显著差异（P<0.01，图4）。

　　3讨论

　　本实验采用全骨髓贴壁法，在冲洗骨髓腔时某些滋养细胞和细胞因子会同时被冲出，与MSCs一同培养，可促使MSCs生长增殖旺盛，活力相对较强。 目前该类方法通常采用的是成年大鼠，虽然成年大鼠可以获得较多的骨髓量，操作也相对方便，但成年大鼠体内MSCs的含量更少，增殖能力也较年幼的动物差，为此，我们采用了12～15 d的大鼠。 根据生长曲线，选取3～4 d的传代细胞用于实验。 MTT实验结果显示T5组可以显著提高rMSCs增殖水平，提示该刺激参数可能是PEMFs刺激MSCs生长与增殖的一个“窗口”。 本实验中，PEMFs作用3 d后，T1，T2，T4组均未能表现出提高细胞增殖水平的作用，但在作用5 d后，各组细胞增殖水平均有提高，说明对于不同的频率和场强，细胞需要不同的刺激时间，才可以对PEMFs产生有效的反应。 倒置相差显微镜下观察到经PEMFs作用的rMSCs体积明显较对照组大，细胞增殖能力旺盛，传代周期明显缩短，培养2～3 d即可进行传代处理。

　　PEMFs作用促进成骨细胞增殖、分化，加速了体外骨形成［8］。 ALP是成骨细胞的早期标志酶，可标志成骨分化的开始。 有研究发现，MSCs向成骨细胞分化的过程中，ALP水平有时间依赖性，随着诱导时间的延长表达量增加［9］。 本实验结果显示，经过5 d的刺激， rMSCs中可检测到ALP的表达，并随时间延长，表达水平逐渐增高，说明rMSCs向成骨细胞分化，并开始分泌骨基质。 PEMFs刺激18 d，四环素荧光标记可观察到相当数量和面积的特征性金黄色，进一步证实rMSCs向成骨细胞分化，并促进了成骨细胞的体外骨形成。 继续刺激，可肉眼观察到圆形或卵圆形的矿化小结，经茜素红染色为阳性，对照组也出现弱阳性反应。 可能的原因是由于培养液或血清的诱导，也可能是由于体外获取的原代细胞含有少量成骨细胞，rMSCs的分离方法还需要进一步改进。

　　PEMFs有促进rMSCs增殖和成骨分化两方面的作用，是PEMFs有效治疗骨折、骨质疏松等骨科疾病的可能机制之一。 但是将PEMFs用于促进rMSCs增殖以获得大量组织工程种子细胞的时候，需要找到更好的磁场参数和培养条件，控制rMSCs的分化，这些都有待今后进一步深入探讨。

　　【参考文献】［1］Sudeepta A， Pittenger MF. Human mesenchymal stem cells modulate allogeneic immune cell responses ［J］。 Blood， 2005， 105（4）： 1815-1822.

　　［2］庞永刚， 崔彭城， 陈文弦， 等。 人骨髓间质干细胞作为骨、软骨组织工程种子细胞的实验研究［J］。 细胞与分子免疫学杂志， 2004， 20（3）： 306-309.

　　［3］曹丰，贾国良，牛丽丽，等。移植时机对骨髓间充质干细胞修复梗死心肌的影响［J］。 第四军医大学学报，2005，26（1）：22-27.

　　［4］罗二平，焦李成，申广浩，等。 不同强度脉冲电磁场对兔股骨骨密度及生物力学特性的影响［J］。 生物医学工程学杂志，2005，22（6）：1168-1170.

　　［5］Simmons JW Jr， Mooney V， Thacker I. Pseudarthrosis after lumbar spine fusion： Nonoperative salvage with pulsed electromagnetic fields［J］。 Am J Orthop，2004， 33（1）： 27-30.

　　［6］赵敏，许建中，周强，等。 脉冲电磁场促进人骨髓间充质干细胞成骨的研究［J］。中国矫形外科杂志， 2004，12（6）：439-443.

　　［7］张小云，张宇。 恒定磁场对骨组织中细胞影响的研究［J］。 中国骨质疏松杂志，2006， 12（4）：333-337.

　　［8］李丽荣，罗二平，申广浩，等。低强度脉冲电磁场对大鼠成骨细胞的影响［J］。 第四军医大学学报，2005，26（6）：571-573.

　　［9］Sammons J， Ahmed N， ElSheemy M，et al. The role of BMP6， IL6， and BMP4 in mesenchymal stem celldependent bone development： Effects on osteoblastic differentiation induced by parathyroid hormone and vitamin D3［J］。 Stem Cells Dev， 2004， 13（3）： 273-280.