血液细胞染色总结

血涂片在用光学显微镜观察前需要固定和染色。固定是将细胞蛋白质和多糖等成分迅速交联凝固，以保持细胞原有形态结构不发生变化。染色是使细胞的主要结构，如细胞膜、细胞质、细胞核等染上不同的颜色，以便于镜下观察识别。血涂片染色方法大多源自罗氏染色法，常用瑞氏染色法、吉姆萨染色法。

（一）瑞氏染色法

1.瑞氏染料由酸性染料伊红（E-）和碱性染料亚甲蓝（M＋）组成。伊红通常为钠盐，有色部分为阴离子。亚甲蓝（又称美蓝）为四甲基硫堇染料，有对醌型和邻醌型两种结构。通常为氯盐，即氯化美蓝，有色部分为阳离子。美蓝容易氧化为一、二、三甲基硫堇等次级染料（即天青）。将适量伊红、美蓝溶解在甲醇中，即为瑞氏染料。甲醇的作用：一是溶解美蓝和伊红；二是固定细胞形态。

2.染色原理：既有物理的吸附作用，又有化学的亲和作用。各种细胞成分化学性质不同，对各种染料的亲和力也不一样。如血红蛋白、嗜酸性颗粒为碱性蛋白质，与酸性染料伊红结合，染粉红色，称为嗜酸性物质；细胞核蛋白、淋巴细胞、嗜碱性粒细胞胞质为酸性，与碱性染料美蓝或天青结合，染紫蓝色或蓝色，称为嗜碱性物质；中性颗粒呈等电状态与伊红和美蓝均可结合，染淡紫红色，称为嗜中性物质；原始红细胞、早幼红细胞胞质、核仁含较多酸性物质，染成较浓厚的蓝色；中幼红细胞既含酸性物质，又含碱性物质，染成红蓝色或灰红色；完全成熟红细胞，酸性物质彻底消失后，染成粉红色。

3.pH值的影响：细胞各种成分均属蛋白质，由于蛋白质系两性电解质，所带电荷随溶液pH而定，在偏酸性环境中正电荷增多，易与伊红结合，红细胞和嗜酸性粒细胞染色偏红，细胞核呈淡蓝色或不染色；在偏碱性环境中负电荷增多，易与美蓝结合，所有细胞呈灰蓝色，颗粒呈深暗，嗜酸性颗粒呈暗褐，甚至棕黑色，中性颗粒偏粗，呈紫黑色。稀释染液必须用缓冲液，冲洗用水应近中性，否则可导致细胞染色反应呈色异常，形态难以识别，甚至错误。

4.试剂配制

（1）Ⅰ液：瑞氏染料1.0g、纯甲醇（AR级以上）600ml、甘油15ml。将染料放入清洁干燥乳钵中，先加少量甲醇慢慢研磨（至少30min），以使染料充分溶解，然后将溶解的染料倒入洁净的棕色瓶内，乳钵内再加入少许甲醇细研，如此多次研磨，直至染料全部溶解，甲醇用完为止，最后加15ml甘油，密闭保存。

（2）Ⅱ液：磷酸盐缓冲液（pH6.4～6.8），由磷酸二氢钾（KH2P04）0.3g、磷酸氢二钠（Na2HP04）0.2g、蒸馏水加至1000ml。配好后用磷酸盐溶液校正pH，塞紧瓶口贮存。

5.染色方法

（1）采血：静脉或毛细血管血1滴，加在距离载玻片一端1cm处。

（2）推片：左手执载玻片，右手持推片，制成舌状，头、体、尾分明的血涂片。

（3）干燥：将血涂片在空气中晃动，使其迅速干燥。天气寒冷或潮湿时，可置37℃温箱中保温促干。

（4）标记：在载玻片一端做好标记。

（5）染色：将血涂片平置于染色架上，滴加Ⅰ液3～5滴，使其迅速盖满血涂片，约0.5～1min后，滴加等量或稍多的Ⅱ液，轻轻摇动玻片或用吸球吹气，使染液充分混合。

（6）冲洗：5～10min后用流水冲去染液，待干镜检。

6.注意事项

（1）血涂片面积太小会影响结果观察，故应在距载玻片另一端2cm处结束涂抹为宜。

（2）血涂片干透后固定，否则细胞在染色过程中容易脱落。

（3）加染液应适量，过少易蒸发形成沉淀，使细胞不易检查。

（4）冲洗时应以流水冲洗，不能先倒掉染液，以防染料沉着在血涂片上。冲洗时间不能过久，以防脱色。如血涂片上有染料颗粒沉积，可滴加甲醇，然后立即用流水冲洗。

（5）染色过淡可以复染，复染时应先加缓冲液，然后加染液。染色过深可用流水冲洗或浸泡，也可用甲醇脱色。

（二）吉姆萨染色法

1.染色原理：吉姆萨染液由天青、伊红组成。染色原理和结果与瑞氏染色基本相同。

2.试剂配制吉姆萨染料1.0g、甘油66ml、甲醇66ml。将染料粉末全部倒入盛有66ml甘油的圆锥烧瓶内，在56℃水浴锅上加热90～120min，使染料与甘油充分溶解，然后加入60℃预热甲醇，充分摇匀后置棕色瓶中，在室温下静置7d，过滤后使用。

3.染色方法

（1）同瑞氏染色（1）～（4）步骤。

（2）固定：将干燥血涂片用甲醇固定3～5min。

（3）染色：将血涂片置于用磷酸盐缓冲液（pH6.4～6.8）稀释10～20倍的吉姆萨染液中，浸泡10～30min。

（4）冲洗：取出用流水冲洗，待干镜检。