直接镜检或抗原检测呼吸道分泌物中检测出非典型病原可直接、迅速确诊，但敏感性低。支原体不能用革兰染色鉴别，直接免疫荧光、酶联免疫吸附法（ELISA）等检测抗原缺乏敏感性；衣原体检测也缺乏特异方法。直接免疫荧光法检测呼吸道、胸水等标本，军团菌检测敏感性达70%.军团菌有一种热稳定及有抗胰蛋白酶活性抗原，其血清浓度低，浓缩尿液浓度可提高30～100倍，易被检出。该法特异性100%，敏感性90%，常用的有放射免疫法（RIA）、免疫层析法（ICT）、直接荧光抗体法（DFA）等，3h内可获得军团菌尿抗原检测结果。发病后3天即可阳性，可持续2个月，甚至超过半年。军团菌抗原出现早（早于IgM），可避免早期特异性治疗影响抗体形成、免疫低下使免疫球蛋白水平达不到诊断标准等造成血清学假阴性，有助于早期诊断，但不能区分新发和既往感染，可结合血清IgM判断。军团菌尿抗原检测仅对军团菌1型（约占军团菌的70%）有效。

　　病原培养

　　非典型病原体的培养均较为困难，肺炎支原体在不良环境中非常脆弱，需及时送检并接种于专用细胞培养基。其生长缓慢，阳性结果需4～20天，阴性报告则需6周，培养阳性时仍需结合临床表现确诊。

　　肺炎衣原体培养需选择特定细胞株，并通过微量免疫荧光（MIF）确认，3～7天可有结果。在排除支原体污染等后，分离培养阳性可确诊衣原体感染。

　　军团菌培养通常需1周，阳性结果有确诊价值。军团菌对生长条件有特殊要求，生长时需L-半胱氨酸和铁盐，从有机化合物中摄取营养，可利用氨基酸作为能量和碳源。目前公认阳性率高的培养基仍是活性碳酵母浸膏（BCYE）琼脂培养基。近年来由于更简便的检测方法及非标准改良培养基的广泛应用使培养阳性率下降医|学教育网搜集整理。

　　血清学检查

　　血清学检测灵敏性、特异性均较好，但对部分早期患者或免疫力低下患者，敏感性较差。

　　支原体IgM抗体阳性是急性感染标志，但再次感染IgM可阴性；IgG在1个月后达峰值，持续数年，可用于流行病学调查。

　　血清学检查是诊断衣原体感染的主要手段。微量免疫荧光法可鉴别IgM和IgG，并区分急性和既往感染。初次感染者IgM在发病后1周出现，可持续6个月；而IgG则在感染后6～8周出现。再次感染后一般无IgM，而IgG滴度可在1周内升至1:512.类风湿因子阳性者可出现假阳性。诊断标准为双份血清抗体滴度呈4倍或以上增高；或IgM≥1:32，IgG≥1:512为急性感染，1:16≤IgG＜1:512为既往感染。ELISA检测血清抗体特异性和敏感性也很高，在排除类风湿因子影响后诊断价值很高。

　　军团菌感染后1周开始出现IgM抗体，2周后出现IgG抗体。间接免疫荧光法（IFA）检查双份血清抗体滴度呈4倍或以上增高、或≥1:128为急性感染。抗体高效价出现需要一定时间，发病1周后约有1/4的患者结果阳性；铜绿假单胞菌、结核菌等可出现假阳性，但效价不高。

　　特异性核酸检测

　　PCR可检测痰液、胸水、组织等标本，灵敏度和特异性很高。其关键是选择特异引物，缺点是容易污染、存在假阳性和假阴性可能、操作过程尚需标准化和规范化。