肽的顺序分析

2013-08-10 11:13 医学教育网

　　公卫助理医师考试中，肽的顺序分析是一个常考的知识点，医学教育网将其重点整理如下：

　　在蛋白质一级结构的测定中，肽的顺序分析是比较重要的一步。肽的顺序分析也有化学法和酶解法两种。

　　1）化学法Edman降解法

　　这是目前用于顺序分析的最主要的方法。它的原理是从N端开始，逐步降解。将肽先与异硫氰酸苯酯（PTH试剂）在pH8-9条件下作用，肽的NH2末端接到异硫氰酸苯酯的C原子上生成苯异硫甲氨酰肽，简称PTC肽，在强酸作用下，可使靠近PTC基的氨基酸环化，肽键断裂形成苯氨基噻唑啉酮衍生物和一个失去末端氨基酸的肽链。此肽不被破坏，因而又可出现一个新的N－末端。重复以上的步骤，继续与PTH试剂作用，继续分析，苯氨基噻唑啉酮衍生物很容易由有机溶剂抽提出来进行鉴定。但此衍生物很不稳定，在水中可转化为稳定的乙内酰苯硫脲氨基酸（PTH－氨基酸）。这些步骤通常称为Edman氏逐步降解法。所以可用来测定氨基酸的排列顺序。Edman降解法的优点是样品用量少，灵敏度高。

　　PTH－氨基酸的鉴定可以用各种层析方法，如纸层析、薄层层析、气相层析和质谱法等，现在多用高压液相层析法。虽然此方法具有很多优点，但是由于操作繁琐，工作量大，所以目前有人根据Edman降解的原理作一系列改进。

　　下面简单介绍几种方法

　　A.1967年Edman及Begg介绍了一种Edman降解的液相自动分析装置，使顺序分析开始走向自动化。将样品先在反应杯内旋转成薄膜，使之固定。然后与PITC试剂反应。再用有机溶剂多次抽提除去过剩试剂，因而样品易丢失，且仪器昂贵，使用受到限制。

　　B.1970年Laursen改进为固相氨基酸顺序仪。此法样品用量少，检出灵敏，可分析20？0肽，其原理是将肽共价结合到惰性支持物上，固定后装柱再行Edman降解。

　　固相顺序仪的惰性支持物有：

　　此法成功的关键是肽段的固定，目前采用C端α羧基固定法，重复法高，其中以高丝氨酸内酯法及双异硫氰酯法（DITC）最好，固定率可达90-95%.

　　C.另外也有从化学反应的角度考虑，试图改进Edman方法。1976年有人将异硫氰酸苯酯的苯基改变为甲氨偶氮苯，试剂为甲氨偶氨苯异硫氰酸盐（简称DABITC）。这是一种有色试剂，产物DABIH氨基酸呈桔黄色，因此鉴定时无需染色，用肉眼即可分辨。此方法灵敏度很高，一次分析小肽段只要几个nanomole样品即可，是目前一种很可取的方法。此外也有人将异硫氰酸酯进行35S标记，使分析样品更向微量化方向发展。

　　2）酶解法肽谱重迭法

　　分析肽段也可采用酶解法，利用专一性不同的两种酶将一个肽分别断裂成更小的寡肽，比较两种方法所得之肽段的重复性，进行氨基酸顺序的装配。例如，有一个肽段，通过氨基酸组成分析已知其为十肽，假如先以糜蛋白酶水解，则得到一套寡肽，再以胰蛋白酶水解此十肽，得到另一套寡肽。分析结果如下：

　　Ala·Phe+Gly·Lys·Asn·Tyr+Arg·Trp+His·Val

　　糜蛋白酶水解

　　+肽（Ala·Phe·Gly·Lys·Asn·Tyr·Arg·Trp·His·Val）

　　胰蛋白酶水解

　　Ala·Phe·Gly·Lys+Asa·Tyr·Arg+Trp·His·Val

　　将此两套寡肽可以做分析比较，因为十肽的N末端及C末端已事先测定分别为Ala及Val，因此第一段寡肽必然是Ala，Phe。