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天花粉药理作用研究

2012-10-25 14:16 医学教育网
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1.致流产和抗早孕作用

1.1.注射用天花粉对早孕兔子宫收缩的影响:

实验用成熟雌兔。以交配日作为妊娠第1日。妊娠第10日时,在戊巴比妥钠麻醉下,经腹部切口将连有细塑料管的乳胶水囊(容积约1ml)置入一侧子宫腔内。细塑料管经腹部和背部皮下,从颈部引出。腹部创口缝复。次日起在清醒状态下记录手术兔的宫内压变化。描记子宫活动时,将细塑料管和乳胶囊以水充盈,塑料管与压力换能器连接,通过记录仪描记子宫收缩活动曲线。所有实验兔在给药前均先记录子宫自发活动,并作催产素试验,即由兔耳缘静脉注射合成催产素(上海第十制药厂产品)0.1单位后,观察子宫反应。给药后24,48,72小时重复记录子宫自发活动和催产素试验。实验共分4组,每组用兔4-5只。对照组:不给任何药物,仅肌肉注射生理盐水0.5ml/兔;天花粉组:妊娠第11日时,肌注注射用天花粉(上海生化制药厂产品,系天花粉蛋白的粗提物的无菌冷冻干燥制 剂,每安瓿含2mg),2mg/kg;甲地孕酮10日天花粉组:于注射天花粉前1小时,肌肉注射甲地孕酮混悬液(由上海第十二制药厂提供)10mg/kg;消炎痛加天花粉组:除肌肉注射天花粉(2mg/kg)外,同时还于妊娠第11、l2、l3日时,肌肉注射消炎痛(以麻油配制),每日2次,每次剂量5mg/kg。实验结果表明,早孕兔的子宫处于完全的静息状态,对催产物质的刺激缺乏反应,但注射足够量的天花粉后24或48小时,就见子宫自发活动逐渐加强,子宫对催产物质的反映性也明显提高医学`教育网搜集整理。

此外,上述实验还证明,天花粉在一定剂量时,对突也有明显抗早孕作用。它可使胚泡坏死、液化,终致完全吸收。天花粉对兔子宫肌的激活作用,虽可被补充外源性孕激素或应用前列腺素合成抑制所防止,但天花粉的抗早孕作用却不被对抗。这一结果提示天花粉终止妊娠的作用,并非继发于激素分泌的抑制,或前列腺素的合成和释放,从而支持天花粉直接作用于胎盘滋养层细胞终止妊娠的结果。

另有报道,取家兔子宫角1.5cm左右悬挂于通气钩上,置玛氏浴槽中,其中有营养液50ml,通以95%O2和5%CO2的混合气体,水浴37℃,子宫活动用杠杆描记于记纹鼓上。先描记子宫自发活动30分钟,然后再加入15-甲基前列腺素F2a(15-甲-PGF2a),测定子宫张力或收缩频率和幅度增加的15-甲-PGF2d最低阈值浓度。对照组动物共进行了6只离体子宫实验,除一个子宫有自发节律收缩外其余5只子宫均无自发收缩,加入15-甲-PGF2a引起张力增加的最低阈浓度为10-1000mg/ml,天花粉组进行离体实验的6只子宫中有5只子宫有明显自发节律收缩,仅一只子宫无自发收缩,加入15-甲-PGF2a引起兴奋的最低阈浓度为l-10mg/ml。实验表明,天花粉能使假孕兔子宫于用药后24小时自发收缩活动增加。

1.2.注射用天花粉对假孕兔子宫孕酮受体(P-R)和雌醇受体(E-R)的影响:取健康成熟雌兔,体重2.5kg以上,静脉注射人绒毛膜促性腺激素(HCG)500单位以产生假孕,注射当天作为假孕1日,然后将动物分成2组,每组7-8只。于假孕第6日、7日给天花粉组每天肌肉注射天花粉注射剂(上海生化制药厂生产,临用前用生理盐水溶解到5mg/2ml)2mg/kgl次。对照组每天注射生理盐水0.8ml/kgl次。于第8日由耳缘静脉取血2ml于含肝素(约0.5mg)的离心管中,离心得血浆供测孕酮用。然后将兔放血处死,立即剖腹取下子宫,剪取一段子宫放入营养液中,供进行离体子宫实验,其余部分用冰生理盐水洗3次,剪碎后与缓冲液按1:3(W/V)比例混合,置于匀浆管中,在低温条件下制成匀浆,供受体测定用。P-R、E-R的测定和KA值的求得采用放射受体测定法,参考Rayard等和Andersan等的方法结合本实验条件略加修改。按Loury法测定子宫胞质液的蛋白含量,二苯胺法测定子宫细胞核的DNA含量,胞质液受体fmol/mg蛋白表示,核受体是以fmol/mgDNA表示。作Scatchardplot求得孕酮和P-R及雌二醇和E-R的KA值。血浆孕酮浓度测定按horneycroft报告的方法,以11a羟孕酮琥珀酸酐牛血清蛋白为抗原,对家兔进行免疫,抗血清效价1:2000以上。

实验结果表明,假孕第八天子宫胞质液和细胞核的P-R含量经t测验,两组间有显著差异,说明注射天花粉后,能使假孕兔子宫的P-R含量降低。作Scatchardplot求得孕酮和胞质液P-R的KA值:对照组KA=1.08x10(9)M-1,天花粉组KA=0.28x10(9)M,说明天花粉使孕酮和P-R的亲和力明显下降。假孕第八天子宫胞质液和细胞核的E- R含量,经t测验,二组间无明显差异,雌二醇和E-R的KA值:对照值KA=1.01x10(9)M-1,天花粉组KA=1.1×10(9)M-1,两组间也无显著差异,表明天花粉组对假孕兔子宫E-R无明显影响。假孕兔第8日血浆孕酮浓度对照组与天花粉组之间无明显差异。

一般认为子宫活动受激素调节,Csapo等报道妊娠子宫所以处于静息状态,是与体内血浆孕酮浓度较高有关,妊娠兔子宫活动可被孕酮所阻抑,并使之对催产素和前列腺素均不敏感。束怀德等。曾报导天花粉能使妊娠兔子宫自发收缩活动增加,认为这种作用可能与天花粉损伤胚胎,使体内孕酮水平下降及促使蜕膜释放前列腺素有关。实验采用假孕兔测得第8日的血浆孕酮浓度,与Balduin等,报道的同期孕兔血浆孕酮浓度相近,注射天花粉后孕酮浓度并不下降,与对照血相似,但能使子宫自发收缩明显增加,说明天花粉对胚胎和蜕膜的损伤以及继发的孕酮下降,可能不是天花粉引起子宫自发收缩增加的主要机理。Hai等报道妊娠大鼠在临床前子宫细胞核中P-R含量下降,认为临床子宫活动增加是由于子宫内P-R含量减少所致。实验曾观察到15-甲-PGF2a对假孕兔有溶黄体作用,血浆孕酮浓度于注射15-甲-PGF2a后24小时下降到极低水平,此时子宫P-R受体含量增加,子宫并无明显自发收缩仍处于静息状态。天花粉不改变假孕兔血浆孕酮浓度,但使子宫P-R含量降低并使孕酮与P-R的亲和力下降,而同时子宫自发收缩活动明显增加。因此设想,天花粉使子宫P-R含量减少和使孕酮与P-R的亲和力降低,可能是天花粉使子宫自发收缩活动增加的重要机理,子宫P-R可能与子宫活动调节有关。

1.3.天花粉对小鼠抗早孕的作用:

取成熟雌、雄小鼠以2:1合笼,每日上午检查阴道,以 发现阴栓日为妊娠1日。于妊娠4、5日,每日皮下注射l次天花粉每10g体重注射0.1ml,于妊娠第8天解剖,记录妊娠动物数。天花粉剂量为10、5、2.5、1.25、0.625mg/kg时,妊娠抑制率分别为100%、81.17%、47.16%、47.16%和12.69%,用简化机率单位法算得天花粉抗早孕作用半数有效量为1.78±0.28mg/kg。

文献报道,单独给予天花粉0.4mg肌肉注射,对早孕小鼠的抑制效果并不理想。上述实验也观察到天花粉能终止小鼠早期妊娠,作用随剂量增加而提高,但在采用使妊娠抑制率达到80%以上的剂量时,可使小鼠体重明显减轻,对机体产生一定毒性。这说明在临床上可能因受到药物毒性的限制,不能通过增加天花粉的剂量来达到提高疗效和缩短流产时间的目的。

1.4.外源性甲地孕酮和绒毛膜促性腺激素对天花粉抗早孕作用的影响方法同上。于妊娠4、5日,每日皮下注射天花粉10mg/kg,同时皮下注射甲地孕酮水混悬液50mg/kg,或腹腔注射绒毛膜促性腺激素(HCG)10I.U,妊娠8日解剖,记录妊娠动物数。结果见表3。合并注射的两组妊娠抑制率均下降。且胚胎均较对照组为小,其中有的与子宫内膜分离,游离于子宫腔内。

1.5.大花粉与15-甲-PGF2a合并用药对小鼠的抗早孕作用:

方法同上。于妊娠4、5日,每日皮下注射天花粉0.625mg/kg,同时皮下注射l5-甲-PGF2a0.0125mg/kg,每日上、下午各1次。已知该剂量15-甲-PGF2a对早孕小鼠妊娠抑制率为20%。至妊娠8日解剖,记录妊娠动物数。结果如表3所示。天花粉与15-甲-PGF2a合并用药组,所有12只小鼠均不妊娠。二药合用所得的小鼠妊娠抑制率为100%(即ED100)。这表明15-甲-PGF0.0125mg/kg与天花粉0.625mg/kg合用时,抗早孕作用不是相加,而是增加。

1.6.结晶天花粉蛋白脂质体对小鼠的抗早孕作用:

选取6-8周体重20-22g健廉雌鼠,按雌雄2:1合笼,发现阴栓者为妊娠第一天。将见栓的雌鼠随机分组,每组10-15只。于妊娠第六天按下列实验设计组给药:第1组结晶天花粉蛋白脂质体(Trichosanthin一Liposome,TL),剂量为每只小鼠注射TL2ug,4ug与8ug,第2组每只注射天花粉40ug;第3组每只注射空白脂质体0.5ml;第4组每只注射盐水0.5ml,作为正常对照。注药后d5解剖小鼠,观察其子宫胚胎发育情况。结果表明,TL抗早孕剂量为2ug/只,而单纯天花粉剂量为40ug/只,其抗早孕率各为66.7%与70%。说明小剂量TL即有明显的抗早孕活性。TL体外释放试验证实,6小时其释放率为4.6%,72小时达68.2%。提示脂质体在节胃药物以及避孕研究的应用是大有可为的。

1.7.天花粉脂质体对早孕鼠血清孕酮水平的影响:

取妊娠6日的小鼠腹腔分别注射不同剂量TL溶液,注药后5日,眼眶放血,收集血清。以放射免疫测定分析孕酮水平。妊娠鼠TL抗早孕的血清孕酮变化。实验结果提示,用药组与对照组比血清孕酮含量差异显著(P<0.01)。TL和天花粉所得数值比较接近,但空白脂质体在早孕过程中孕酮含量无明显变化。关于天花粉的引产原理,根据目前的研究情况可以归纳为:天花粉蛋白能直接作用于胎盘滋养层细胞、并有一定的细胞专一性;能选择性地使胎盘绒毛合体滋养层细胞变性坏死,解体的细胞碎片留在血窦中,引起凝血造成循环障碍和进一步的大量组织坏死。胎盘绒毛的损伤反映在功能方面,即绒毛膜促性腺激素(HCG)和甾体激素迅速下降到流产的临界水平以下。由于胎盘形态和功能严重损伤的结果,破坏了母体与胎儿之间的内分泌关系和代谢物的交换,并可能通过尚未弄清楚的机制引起前列腺素合成的增加,发动宫缩而导致流产。此外,天花粉能使小鼠离体子宫、兔在体子宫收缩增强,并能提高子宫对垂体后叶素的敏感性,其对子宫平滑肌的直接兴奋作用,可能也是导致流产的因素之一。

2.抗癌作用

2.1.对小白鼠早期移植肝癌腹水型治疗作用:

选择18-22g健康小白鼠皮下注射瘤细胞悬液(原倍或1:1)0.2ml/只,24小时后称重随机分组。治疗组皮下注射天花粉0.2ml/只(5mg/kg),间隔4-6日再按原剂量皮下注射天花粉1次。对照组小白鼠皮下注射生理盐水0.2ml2次,间隔时间同治疗组。

同时对治疗组与对照组分别抽取1ml/只腹水进行细胞病理学检查,观察细胞总数和细胞分类。结果表明天花粉治疗腹水型肝癌,可使腹水量减少,生存期延长:实验按天花粉皮下注射2针的方案重复2批。生存期延长率达61-76%,体重增加比对照组少,说明治疗组腹水量少,生存期平均29-30日,最长者达60日还未见腹水生长而处死。生存期比对照组明显延长,差别显著P<0,05(见表5)。治疗组小白鼠大多数未见腹水产生,最后都死于毒性反应,偶见个别小白鼠有少量腹水,病理检查表明腹水中总细胞数少,绝大多数为淋巴细胞,并出现淋巴细胞包围癌细胞的所谓卫星现象,还有中性白细胞和巨噬细胞。对照组最后由于肝癌大量腹水衰竭死亡,腹水中细胞总数多,绝大部分是癌细胞。第3批治疗实验,改为癌细胞接种后24小时皮下注射天花粉0.2ml/只1次,不再治疗,实验说明治疗组生存延长率地可达85.6%,但治疗组小白鼠也长腹水,最后都死于肝癌。

2.2.对小白鼠晚期移植肝癌腹水型治疗作用:

选择18-22g小鼠皮下注射瘤细胞悬液(1:1),24小时称重随机分组,间隔6日腹水已长成,称重后治疗组皮下注射天花粉0.2ml/只,间隔4日称重后皮下注射天花粉0.4或0.2ml/只,对照组皮下注射生理盐水0.2m1/只,间隔时间同治疗组。结果天花粉注射1次后腹水量明显减少,腹水抑制率达73%(P<0.05)

2.3.对小白鼠肝癌实体瘤型的治疗作用:

实验方法同上,结果显示天花粉对小白鼠肝癌实体瘤抑制率可达36-38.9%,治疗组瘤体明显小于对照组(P<0.05)。

2.4.结晶天花粉蛋白对体外培养的肿瘤细胞的抑制作用:

Jar细胞培养于含10胎牛血清的RPMI1640人工培养液,加有青链霉素各100ug/ml。Hela和Fib细胞用DMEM培液,其中胎牛血清和青、链霉素含量同前。以上3种细胞均呈单层贴壁生长。按文献37方法进行实验。

实验结果表明,结晶天花粉蛋白对Jar人绒癌细胞的增殖有明显的抑制作用,培育48小时后的皮内注射50为3.3ug/ml,而Hela人宫颈癌细胞和正常纤维细胞的皮内注射50分别为13.0和16.0ug/ml。此外,结晶天花粉蛋白对Jar细胞的hCG分泌显示更强的抑制作用,培养48小时后,抑制50%,hCG分泌的结晶天花粉浓度为1.3ug/ml。

2.5.另有报道,天花粉温浸冷冻干燥剂和水浸剂,对子宫癌U-14的抑制率分别为40.4%和30.9%,而煎剂对子宫U-14无作用。近年报道天花粉能抑制艾氏腹水癌

细胞生长,延长荷瘤小鼠的存活期。

3.对免疫功能的影响

3.1.天花粉对荷瘤小鼠红细胞免疫功能的影响:

健康昆明种雄性小鼠,2-3月龄,体重21.3±4.6g,天花粉组和肿瘤小组小鼠腹腔接种细胞癌细胞悬液,正常组皮下注射等体积生理盐水。天花粉组于接种24小时后皮下注射天花粉0.2ml(0.2mg)。其他组给予等体积生理盐水。各组动物于接种肿瘤后ll日分别摘眼球取血,RCIA红细胞完全结上一个以上酵母细胞为一花结,CIC以1:8稀释度出现(++)为阳性。由表7可知,天花粉组与正常组小鼠的红细胞C3b受体花结(RBC-RR)在同一水平,肿瘤组明显降低,其差异非常显著(P<0.01),表明荷瘤小鼠红细胞C3b受体活性明显受损,经天花粉治疗后,可使其恢复至正常水平;天花粉组小鼠红细胞免疫复合物花结(RBC-ICR)增高,与其他两组均有显著差异(P<0.01),提示天花粉可增强荷瘤小鼠红细胞粘附免疫复合物的能力。这一结果与CIC测定相一致。并与文献报道互为印证。

3.2.天花对小鼠唾液腺内凝集素受体和免疫球蛋白的影响:

动物为20只成年雄性健康ICR纯系小鼠,体重18-22g,分为2组,每组10只,第1组为天花粉组,每日1gl次,每次0.5ml(浓度65mg/ml),共7日,药液的制备用常规水提法进行,第2组为对照组,每日皮下注射l次,每次0.5ml生理盐水。8日,杀死小鼠,取其唾液腺,分别作HE和其它染色。结果表明,小鼠颌下腺内PNA,PBA受体显著增加,IgG明显增多、酸性粘多糖也高于对照组,提示天花粉与促进唾液腺内半乳糖和乙胺半乳糖的合成以及增加机体免疫功能有关。

4.抗菌及抗病毒作用

天花粉煎剂在体外对溶血性链球菌、肺炎双球菌、白喉杆菌有一定的抑制作用,对伤寒杆菌、绿脓杆菌、痢疾杆菌、变形杆菌及金黄色葡萄球菌的作用均较弱。采用病变抑制法和125I放射免疫法在3种细胞培养系统上测定了天花粉蛋白对7种病毒的抑制作用。结果表明,天花粉蛋白浓度在10ug/ml以下时,对细胞无明显的毒性作用,在0.001-10ug/ml时对乙型脑炎、柯萨奇B2、麻疹、腺病毒3型单纯疱疹病毒I型、水泡性口炎病毒及乙型肝炎病毒等均有明显的抑制作用,并且这种抑制作用随天粉蛋白的浓度增大而提高。浓度在0.01ug/ml时可以抑制由100TC皮内注射50病毒引起细胞病变的50%、提示,天花粉可能是继干扰素之后另一种具有广谱抗毒作用的蛋白质。

5.抗艾滋病病毒

体外实验表明,天花粉蛋白可抑制艾滋病病毒(HIV)在感染的免疫细胞内的复制,减少免疫细胞中受病毒感染的活细胞数,其有效抑制浓度为0.05-10ug/ml。一种能抑制HIV感染和复制的蛋质称为抗-HIVTA29。临床资料亦表明有一定的治疗效果。

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