细菌对该类抗生素可呈自然的和获得性耐药，细菌对该类抗生素相互间存在部分或完全的交叉耐药。耐药性主要通过质粒介导产生钝化酶，使它们结构中的游离羟基磷酸化或核苷化，使游离氨基乙酰化，从而失去抗菌活性，该类多种抗生素可被同一种酶钝化，而同一种该类抗生素又可被多种酶钝化。细菌细胞壁通透性的改变和胞内转运功能的异常，亦是产生耐药的原因之一。另外，肠球菌属细菌和结核杆菌的突变株对链霉素耐药，是由于细菌对链霉素靶位蛋白的修饰作用，使链霉素不能与之结合而发生耐药。