时间分辨荧光免疫测定（TRFIA），跟着小编来学习一下吧！

用镧系元素标记抗原或抗体，用时间分辨技术测量荧光，同时检测波长和时间两个参数进行信号分辨。

（一）基本原理

1.时间分辨

正常组织在激发光照射下可以发出一定波长的荧光，但该荧光寿命较短（1～10ns），而镧系元素螯合物的荧光寿命较长（10～1000μs）。故待短寿命背景荧光完全衰变后再测定镧系元素离子螯合物的特异性荧光信号。

2.Stokes位移：激发光谱和发射光谱的波长差，如果Stokes位移小，激发光谱和发射光谱常有重叠，相互干扰，影响检测结果的准确性。镧系元素位移大。

3.发射光谱和激发光谱：镧系元素发射光谱带较窄，多在613nm±1Onm。利用滤光片只允许此波段的荧光通过，避免干扰。

4.荧光标记物的相对比活性：比活性是指单位时间内每个标记分子可被探测到的信号量。

5.信号增强

Eu3＋标记抗原抗体复合物在弱碱性溶液中被激发后的荧光信号较弱，加入一种酸性增强液可使Eu3＋从复合物上完全解离下来，并与另一种螯合剂所螯合，以增强荧光信号。

（二）标记物和标记方法

1.标记物：多用Eu3＋和Tb3＋为标记物，其中Eu3＋最为常用。

2.标记方法：镧系元素离子不能直接与抗原或抗体结合，需应用具有双功能基团的螯合剂，其一端与镧系元素离子结合，另一端与抗原或抗体蛋白分子上的氨基结合。

（三）方法类型

1.双抗夹心法：待检抗原与固相抗体结合，再与Eu3+标记抗体结合，在酸性环境下，复合物上的Eu3+解离下来，在340nm激发光照射下，形成荧光。

2.固相抗体竞争法：待检抗原和Eu3＋标记的抗原与固相抗体竞争结合，荧光强度与待检抗原成反比。

3.固相抗原竞争法：待检抗原和固相抗原竞争Eu3＋标记抗体，荧光强度与待检抗原含量成反比。

（四）方法评价

1.优点：

灵敏度高；分析范围宽；标记结合物稳定，有效使用期长；测量快速，易自动化；无放射性污染。

2.缺点：

易受环境、试剂和容器中的镧系元素离子的污染，使本底增高。

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