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酶免疫技术中酶和酶作用底物是怎么样的呢?

2020-12-10 14:04 来源:医学教育网
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备考很痛苦,等考试完回头看的时候你会感觉很幸福!关于检验职称的考试,相信很多朋友都想知道“酶免疫技术”的相关知识,为此医学教育网小编为大家整理了“酶免疫技术中酶和酶作用底物”相关内容,希望对大家有所帮助,祝大家考试顺利,取得好成绩!

酶和酶作用底物

(一)酶的要求: 

一个酶蛋白分子每分钟可催化10 3 ~10 4 个底物分子转变成有色产物。用于标记的酶应符合:

1.酶的活性要强,催化反应的转化率高,纯度高。

2.酶催化底物后产生的产物易于判断或测量,方法简单易行、敏感和重复性好。

3.作用专一性强 ,酶活性不受样品中其他成分的影响,受检组织或体液中不存在与标记酶相同的内源性酶或抑制物。用于均相酶免疫测定的酶还要求当抗体与酶标抗原结合后,酶活性可出现抑制或激活。

4.易与抗体或抗原偶联 ,标记后酶活性保持稳定,且不影响 标记抗原与抗体的免疫反应性 。

5.酶、辅助因子及其底物对人体无害 ,酶的底物易于配制、保存,酶及其底物应价廉易得

(二)常用的酶

1.辣根过氧化物酶(HRP):

目前酶联免疫吸附试验中应用最广泛 的标记用酶。

由无色的糖蛋白(主酶)和亚铁血红蛋白(辅基)结合而成的复合物。

辅基是酶活性基团 ,而主酶则与酶活性无关 ,HRP的纯度用RZ(HRP分别在403nm和275nm处的吸光度比值)表示,RZ值应大于3.0 。

RZ值仅说明血红素基团在HRP中的含量 ,并非表示HRP制剂的真正纯度,而且RZ值高的HRP并不意味着酶活性也高,RZ值与酶活性无关 。

酶活性以单位U表示: 即1分钟将1μmol底物转化为产物所需的酶量。酶变性后,RZ值不变但活性降低 ,因此使用酶制剂时,酶活性单位比RZ值更为重要。

2.碱性磷酸酶(AP):

大肠杆菌来源 的AP分子量80kD,酶作用最适pH为8.0 ;小牛肠黏膜AP 分子量为100kD,最适pH为9.6 ;后一种AP的活性高 于前者。

3.β-半乳糖苷酶(β-Gal):

β-Gal来源于大肠杆菌。因人血中缺乏此酶,以其制备的酶标志物在测定时不易受到内源性酶的干扰 ,从而提高特异性,被用于均相酶免疫测定 。

(三)常用的底物

1.HRP的底物

(1)邻苯二胺(OPD):

 是HRP最为敏感的色原底物之一。OPD在HRP的作用下显橙黄色 ,加强酸 如硫酸或盐酸终止反应后呈棕黄色 ,最大吸收峰在492nm 波长。OPD应用液稳定性差,易变色,需新配制后在1小时 内使用,显色反应过程需避光 ,而且具有致癌 性。

(2)四甲基联苯胺(TMB):

 TMB经HRP作用后变为蓝色,加入硫酸终止 反应后变为黄色 ,最大吸收峰波长450nm。TMB稳定性好,成色无需避光 ,无致突变作用,是目前ELISA中应用最广泛的底物 。缺点是水溶性差 。

(3)其他:

5-氨基水杨酸(5-ASA)和2,2-联氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二铵盐(ABTS)。

2.AP的底物

常用对-硝基苯磷酸酯(p-NPP) ,p-NPP经AP作用后的产物为黄色 对硝基酚,最大吸收峰波长为405nm。

3.β-半乳糖苷酶(β-Gal)的底物

常用4-甲基伞酮基-R-D半乳糖苷(4-MUU),酶作用后,生成高强度荧光 物4-甲基伞形酮(4-MU),其敏度性较HRP 高30~50倍,但测量时需用荧光计。

以上内容是由医学教育网小编为大家编辑整理的“酶免疫技术中酶和酶作用底物”相关知识,还请大家多多关注医学教育网,会有更多更好的关于各类医学考试的信息等着大家。今日事今日毕,今日也要努把力!

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