1.Sp2/0在融合前生长反而不好，有死亡现象，是否因为培养过久，传代过多所致？大概养了3周。
2.在做融合实验前我采集小鼠血清，请问血清在－20度能存多久？抗体效价是否会下降？
3.融合后铺的96孔板换液时枪头需不需要每一孔都换啊？一般是半换液还是全换液呢？如果在融合一周后换，培养上清中不是可能有抗体吗？弃之？
4.我前一段时间自配了HT母液，－20度分装冻存，前天拿出来配应用液时发现有一层东西黏附在冻存管周围？请问是怎么回事？还能用吗？
还有：
我制备的有的饲养细胞板中饲养细胞不多，感觉融合细胞生长状态不好，是否需要补种饲养细胞？
wfy2004026 wrote:
本人单抗制备进行中，碰到几个问题，请教大家：
1.Sp2/0在融合前生长反而不好，有死亡现象，是否因为培养过久，传代过多所致？大概养了3周。
2.在做融合实验前我采集小鼠血清，请问血清在－20度能存多久？抗体效价是否会下降？
3.融合后铺的96孔板换液时枪头需不需要每一孔都换啊？一般是半换液还是全换液呢？如果在融合一周后换，培养上清中不是可能有抗体吗？弃之？
4.我前一段时间自配了HT母液，－20度分装冻存，前天拿出来配应用液时发现有一层东西黏附在冻存管周围？请问是怎么回事？还能用吗？
1.传代过多会引起细胞的反祖或变异现象，由于SP2/0为缺陷株，在不能确定是否对HAT培养基敏感的情况下，可用8－杂氮嘌呤处理。但这不会引起细胞的死亡现象，死亡现象可能是由于细胞本身活力和培养基的原因，建议用与融合后培养的同种培养基，血清浓度达15％以上时，应该传代培养不需3周。这个时间太长。
2.半年应该没有问题，最好分装保存。
3.枪头可以不每孔一换，但要保证不污染。我们是3天后直接补加，后期依细胞生长状态换液，半换较好些。一般克隆形成依铺板时细胞数量的不同，时间长短也不同。一周内克隆的个体一般不会太大，换液没有问题，若开始分泌抗体，换液后两天即可达到应有的水平，不会影响检测。不过如果克隆已经很明显，则可直接检测该上清。
4.没遇到过这类情况，不好说。
wfy2004026 wrote:
还有：
我制备的有的饲养细胞板中饲养细胞不多，感觉融合细胞生长状态不好，是否需要补种饲养细胞？
饲养细胞最好在融合前或与融合细胞同时加入，以起到优化生长环境的作用。可以适当的加些饲养细胞试试看，但不可太多。
谢谢小蚂哥！
我来锦上添花一下：
1.－20度保存血清最好是用50％甘油，如果不使用甘油的话最好多冻存几支，反复冻融绝对会影响抗体的效价，一般小鼠眼球采血可得500ul左右血清，而且效价很高的话50ul冻存一支可以用很长时间
2.不知道你们有没有那种医院用的电动吸液泵，换液时用很方便，但一般都是半孔换液，不会影响到细胞；只要细胞没有被吸掉，那么抗体总是会有的
3.自配的HT是有这种毛病，我们也常遇到，这是HT在4度析出了，可以在实验之前放37度半小时，如果还是不溶（常有），就用吸管吹匀，加入配液后就完全溶解了
4.个人认为三天到一周之内补加培液的目的，不是对营养的补充而是对培养环境的改善，因为这段时间内多数非融合细胞因死亡而裂解，孔内大浓度的细胞裂解液对处于分裂初期的融合细胞是具有很大的毒性的，而抗体检测只有当克隆已经达到目测水平时才可以进行，此时恐怕为时过早
借LZ贵地请教一下，加入HAT筛选后，SP2/0是不是头两天就可见大规模死亡？细胞碎片对融合细胞的生长会不会有影响？有时候觉得3天基本SP2/0就死完了，板中很多碎片，很担心融合细胞会不会也死了。个人认为HAT的使用浓度可能根据试剂纯度不同是不是有差异，是不是也该根据细胞情况加以调整，你们都是怎么确定调整的？不知大家做筛选时SP2/0一般要等好久才死完，有没有什么方法可以确定？
midaizi wrote:
借LZ贵地请教一下，加入HAT筛选后，SP2/0是不是头两天就可见大规模死亡？细胞碎片对融合细胞的生长会不会有影响？有时候觉得3天基本SP2/0就死完了，板中很多碎片，很担心融合细胞会不会也死了。个人认为HAT的使用浓度可能根据试剂纯度不同是不是有差异，是不是也该根据细胞情况加以调整，你们都是怎么确定调整的？不知大家做筛选时SP2/0一般要等好久才死完，有没有什么方法可以确定？
我的体会是，可以目测的大规模死亡一般在3－5天内。细胞碎片或多或少肯定有些影响，但不会对融合细胞产生根本性的影响，事实上在细胞死亡后，细胞碎片是很多的，而且无法处理。3天细胞死亡应该是很正常的，融合细胞是否死亡只有看运气了。
HAT浓度可以做筛选调整，如果有已经建立的杂交瘤细胞株的话，可以用来做个剃度看看，在什么浓度下对杂交瘤也有影响。另外再用sP2/0做筛选，看看在什么浓度下，SP2/0会死亡。选择浓度应该介于这二者之间。如果没有条件的话，就用1％的浓度应该问题不大的。
细胞死亡时间3－5天，或长或短，但一般不超过一周，没有什么好的方法确定，事实上，细胞也不可能完全死完的，比如混在饲养细胞中的纤维状细胞就比较难死，但只要有明显的克隆形成，而且生长正常的话，这些在后期的亚克隆中是可以去掉的。
那么融合细胞的初步筛选，即检测阳性抗体孔，一般是在什么时候？校价与母体免疫小鼠的血清校价相比差别大不大？如果血清校价1：1万可以测出的方法，能够检测出阳性孔的上清抗体吗？如果不能，如何确定是没有阳性孔还是抗体太少导致检测不出呐？
midaizi wrote:
那么融合细胞的初步筛选，即检测阳性抗体孔，一般是在什么时候？校价与母体免疫小鼠的血清校价相比差别大不大？如果血清校价1：1万可以测出的方法，能够检测出阳性孔的上清抗体吗？如果不能，如何确定是没有阳性孔还是抗体太少导致检测不出呐？
1、检测阳性抗体孔没有固定的时间，快的话10天左右，慢的话可能要15天左右，根据细胞的长势，分批检测。一般以能够目测到较大的克隆，约占孔1/5左右吧，如果效价高再小点也有可能检出。
2、效价与血清差别还是有的，由于细胞数量的有限，效价自然要低，不过按照上清1：1或1：2稀释后来检测还是能够检出来的。
3、如果第一次没有检测出来可以2天后再次取样检测，如果连续几次都检测不出来的话，应该就是阴性的克隆，可以丢掉。
这样啊，受教了，谢谢waynepionnet !
我也来请教一个问题吧:
我最近复苏一只冻存了5年的骨髓瘤细胞,想扩大培养,再筛一遍.结果刚复苏出来的时候看着细胞还是挺多的,也有贴壁的.可过了两天，细胞就都没了.现在里面细胞已经非常少了,基本上这次是失败了.
想请问一下,这样的条件下，我需要换培养液么?
再问一下,这样的情况下,怎么样的处理会比较好一点?
waynepionnet wrote:
1.一般以能够目测到较大的克隆，约占孔1/5左右吧，如果效价高再小点也有可能检出。
2.按照上清1：1或1：2稀释后来检测还是能够检出来的。
请问：
1.怎么个目测法啊？是在板底看吗？
2.检测培养上清需要稀释吗？用什么稀释？
alfred_zhu_cn wrote:
我也来请教一个问题吧:
我最近复苏一只冻存了5年的骨髓瘤细胞,想扩大培养,再筛一遍.结果刚复苏出来的时候看着细胞还是挺多的,也有贴壁的.可过了两天，细胞就都没了.现在里面细胞已经非常少了,基本上这次是失败了.
想请问一下,这样的条件下，我需要换培养液么?
再问一下,这样的情况下,怎么样的处理会比较好一点?
1.刚复苏的细胞尽量用小培养瓶培养。
2.培养基血清质量非常关键。
3.培养骨髓瘤细胞一定要注意传代的时间，若不能及时传代致使细胞生长过度，极易导致你所描述的现象，此时细胞很难再救活，失去培养意义，建议你重新复苏。
wfy2004026 wrote:
waynepionnet wrote:
1.一般以能够目测到较大的克隆，约占孔1/5左右吧，如果效价高再小点也有可能检出。
2.按照上清1：1或1：2稀释后来检测还是能够检出来的。
请问：
1.怎么个目测法啊？是在板底看吗？
2.检测培养上清需要稀释吗？用什么稀释？
1.在显微镜下观察，估计一下大小就可以了。
2.一般每样做两孔，比照一下，50ul/孔，可以适当稀释一下，比如1：2稀释，影响不大，一开始主要是找到阳性克隆就行了，选择较好的几孔克隆。
感谢 风雨の人生 :
1.刚复苏的细胞尽量用小培养瓶培养。
2.培养基血清质量非常关键。
3.培养骨髓瘤细胞一定要注意传代的时间，若不能及时传代致使细胞生长过度，极易导致你所描述的现象，此时细胞很难再救活，失去培养意义，建议你重新复苏。
现在已经渐渐长出来了,还可以.自己觉得可能是换液稍微慢了一点,也许复苏出来的第二天就应该换液,去处死细胞.还觉得,操作时,应尽量轻缓一点,保护贴壁的细胞.
请教一个问题：
我也正在做单克隆抗体，我想用ELISA方法对杂交瘤进行筛选，我们实验室有HRP标记的羊抗鼠IgG，如果用来进行单抗的筛选，得到的单抗是不是都是IgG亚类，那么IgM类型不就漏掉了吗？有没有针对所有Ig的酶标抗体，我没有找到，我该如何进行筛选？敬请赐教，谢谢！！
对，理论上IgM可能会漏掉，但实际中似乎不完全这样。用你所用的IgG-HRP，也经常有筛到IgM的报道，可能是交叉反应的原因吧。IgM比较讨厌，结构太花哨，一般作检测不大用它，当然如果有特殊目的可能要考虑方法变换。
rapidtest说的很有道理，由于同种异类Ig的轻链结构抗原性相似，因而常常会出现交叉反应，即在筛选中如果用抗小鼠IgG H+L的抗体，就有可能筛选到IgM的单抗。
请教一个问题：
我也正在做单克隆抗体，我想用ELISA方法对杂交瘤进行筛选，我们实验室有HRP标记的羊抗鼠IgG，如果用来进行单抗的筛选，得到的单抗是不是都是IgG亚类，那么IgM类型不就漏掉了吗？有没有针对所有Ig的酶标抗体，我没有找到，我该如何进行筛选？敬请赐教，谢谢！
有goat anti mouse Ig(H+L)-HRP, 我们用的是southernbiotech的，效果不错，一直在用。其实有时候，得到IgM类的单抗会影响到以后的应用，交叉反应也多，我们倒不希望是IgM的！
筛选时用间接ELISA法，用抗原包被酶标板，加入杂交瘤培养上清，孵育后洗板，加二抗后就可以显色了，注意要做阴性和阳性对照，特别是融合后第一次筛选的时候。
我还有几个问题:
1.饲养细胞大概多久死啊？我融合后都两周了，饲养细胞还是好好着的。而且，好像还有增殖呢。
2.我的克隆怎么长不到1/5孔就已经死了啊？
wfy2004026 wrote:
我还有几个问题:
1.饲养细胞大概多久死啊？我融合后都两周了，饲养细胞还是好好着的。而且，好像还有增殖呢。
2.我的克隆怎么长不到1/5孔就已经死了啊？
1.事实上饲养细胞不是很纯的，除了巨噬细胞、淋巴细胞，可能会有其它杂细胞，比如组织中纤维细胞等，有些细胞自始至终好像都不会死亡，正如你所说，当后期换为HT或正常培养基后，活下来的细胞可能增殖，所以克隆得及时亚克隆，但这些细胞在克隆后往往会死亡，具体机理我也不是很清楚，大家可来探讨一下。
2.1/5只是一个参考值，并不是说一定要长到1/5才能亚克隆，关键还在于自己对克隆的判断，毕竟还是存在个体差异的嘛如果出现克隆后检测是强阳性的，自己不能很好判断细胞长势的话，就直接亚克隆吧，省得夜长梦多。
推荐学习，20021108战友整理的关于单克隆抗体制备的帖子，内容很不错。
>
各位单抗前辈：今年做融合做了5次一次都没融合上，愁死了，帮忙分析一下原因：
1。SP2/0细胞在融合前出现很多大的细胞，用8N培养不死，但是对HAT耐受性也非常强，三天也不能把它完全杀死，换用其他批次的细胞，在培养过程中还是会产生。大细胞的产生没有影响其他细胞的生长。这与血清还是抗生素有关吗。（培养基是20%1640+1%双抗）
2。我们这边PEG用的是4000，自己配的。（0。6g高压过的PEG4000+12滴1640）PH值在7-7。5左右。
另外可能还有一些关键因素，请各位高手指点帮忙，我快不行了，来不及毕业了，郁闷崩溃中啊……
异常感谢！
1.这种细胞不能用了，如果HAT三天不死就得换，你用96孔板做一个单克隆筛选一下sp2/0，选择形态亮度都不错的细胞扩大培养，一般96孔的环境是最有利于细胞生长的，如果还出现大细胞就更换细胞株吧
2.建议你寻找一下其他课题组的同学用不同的培液、血清对你的细胞进行培养，看看有没有出现相同的情况
3.用1500的PEG试试
很多大的细胞是什么样的，是不是与SP2/0形态相近，但大小不一，出现在什么时期，还是一直都有？如果是在培养过程中出现的话，有可能是SP2/0细胞处于生长分裂阶段，没有关系的。如果是一直都有的话，就按jevens_lee的建议，筛选一下，或换一下细胞。双抗浓度过高，是会影响细胞形态的，但1％应该没有问题。
有报道说PEG在8.0左右融合效果好，但没比较过。PEG3000左右都没问题，融合的操作很重要，时间得把握好。因为PEG的分子量大小、浓度与毒力有关，所以融合时间的长短，在什么时候终止，得控制好。
其他同意jevens_lee的观点。
我用96孔板取过单克隆细胞增殖过,用8N鸟嘌呤培养基培养,但是还没长满96孔板,又出现大细胞,呈单个分布.基本不分裂,形态大,亮.对8N没作用,用HAT杀,也不容易杀死.在其他均一的SP2/0细胞死亡后仍可见.用过3批不同的血清试过,均出现这种状况.细胞批次也选用不同的,在传代过程中也有大细胞生成.
据说以前也有但不多,现在10倍镜一个视野可见5-10个.
还有这些天融合有一次有两个融合孔但是没有阳性,后来把PEG很精确的调整到50%,PEG加入时用了60s,再作用2分钟后,然后缓慢加入HAT完全培养基终止.这个PROTOCAL是我们老板给的,会不会有问题啊,但是结果今天第五天几乎没有融合孔.
我准备28号再做融合,所以请大家多帮忙啊!
同时非常感谢jevens_lee及waynepionnet的帮助!
不要心急，第五天都没有发现融合孔也很正常，建议你不要太早下结论，一周后按原计划更换培液试试，你也可以在融合后第三天就换半孔培液，但要十分小心。
你的离心是用多少转的？刚融合的细胞非常脆弱，离心转速不可以超过800rpm。
还是建议你更换PEG，一般分子量越大似乎对细胞的毒性越强。
离心用的速度是800rpm，好象也没有太大问题。现在用了单克隆孔培养出来的细胞好象没那么多大细胞了，不过还有。
我们融合的时候将小鼠腹腔巨嗜细胞加入到HAT培养基里，然后再重悬融合的细胞，铺板的时候每孔100u，以前我们都是到第五天才换液，不知道会不会换液不及时使融合的细胞死掉。
因为有师姐说三天内换液会冲散融合细胞，不利于其生长。但是我看见斑上好多前辈都说三天补液或加液，请问我们这种做法会不会导致无融合细胞生长。
我们铺板梯度稀释细胞，一开始加入40ml,铺完l块再补加HAT至40ml,依次扑满5快96孔板。第一，二块板总觉密度太大，这会有影响吗？
谢谢各位了！
离心以前园子里有不大于500g的说法，我们一般用的800rpm，没去计算过g大小。
终止的时候用的是基础培养基，不需要用HAT的。
换液是一个动态的掌握，主要根据细胞的长势来看，如果细胞张的快而没有及时换液，肯定是有影响的。
剃度铺板是没有问题的，如果自己不能很好把握细胞的浓度，用这种方法还是比较合适的。
请教：
1.亚克隆后第八天仍然没有看见明显的克隆集落形成，是不是表示亚克隆失败？
2.亚克隆是在单个细胞的基础上分化出来的，那么克隆集落出现的时间是不是要比融合后长呢？
谢谢指教！
1、情况不是很妙，在等两天看看吧，如果两周以内没有结果的话，肯定是失败了。
2、是要稍长些。
yuerhaoren wrote:
离心用的速度是800rpm，好象也没有太大问题。现在用了单克隆孔培养出来的细胞好象没那么多大细胞了，不过还有。
我们融合的时候将小鼠腹腔巨嗜细胞加入到HAT培养基里，然后再重悬融合的细胞，铺板的时候每孔100u，以前我们都是到第五天才换液，不知道会不会换液不及时使融合的细胞死掉。
因为有师姐说三天内换液会冲散融合细胞，不利于其生长。但是我看见斑上好多前辈都说三天补液或加液，请问我们这种做法会不会导致无融合细胞生长。
我们铺板梯度稀释细胞，一开始加入40ml,铺完l块再补加HAT至40ml,依次扑满5快96孔板。第一，二块板总觉密度太大，这会有影响吗？
谢谢各位了！
800rpm肯定没有问题，我做的时候又一次做懵了，离了5分钟之后发现用的离心速度是8000，当时我以为肯定不行了，但是还是长克隆了，所以说离心不是决定性的因素。
第五天换液没有问题，因为我们有个同学在苏州做单抗，在换用HT之前他们是不换液的，也就是８天不换液。我没敢用这方法，我是３－５天半量换液的，你们师姐说的有道理，过早是会冲散本就不多的细胞。
没有必要梯度稀释细胞，离心后直接稀释到４０ml的离心管中然后每孔上５０ul，一共种８块板子多方便。骨髓瘤大概用３瓶７５的，密度要到９０％左右。
还有就是融合过程的问题了，总之是要在混匀的前提下尽量的轻柔。还有就是每个实验室都有自己不同的supplement，这个也很重要哦。
以上仅供参考。
小弟初来贵地，看了大家的帖子后，对我受益不少。不过实验出现的问题还是有几个没有明白：
1.我的融合没有成功，但几天后包括饲养细胞也看不见了，这正常吗？
2.融合后,融合细胞是用HAT培养基还是完全培养基吹匀加到96孔板里?（200ul是五天后换液还是如"20021108战友整理的关于单克隆抗体制备的帖子"提到的24HR后就加?
3.苔酚蓝染色我没有观察到细胞,请问具体的操作是怎么样的?
4.PEG准备时所说的1640是什么？(DMEM可以吗?)
5.融合时PEG的加入方法有很多种,具体怎么比较好一些?
1.肯定不正常，如果所有细胞都死亡了，可能就不是融合的问题了，应该在培养基或血清上找原因，可以做个SP2/0培养实验，看看是否正常。
2.融合后的细胞就是用HAT培养基来悬浮，铺板后就进入筛选培养阶段。换液可能因个人操作习惯确有不同，我们一般都是3天后先补加50ul，然后再换液。
3.这一步做与不作其实问题不大，我们一般都是不作的。
4.PEG一般用基础培养基来稀释，有资料报道用DMEM的，不过偶没做过验证实验。
5.我觉得这个很难界定哪一种方法最好，因为这可能因实验室的PEG的分子量、浓度选择不同，在操作中有一定差异，所以需要自己的摸索。一般就是在控制PEG的毒力和起到融合效果之间找到一个平衡点。提供我们的融合方法:50%PEG3000 1ml，匀速滴加1min，边加边旋转，气温低时需在37C水浴，加完后，1min内加10ml基础培养基稀释，其后1-2min中加10ml培养基终止反应，在于37C水浴静置10min后，取出离心。操作过程中注意均匀。
