Doc2.doc (86.0k)
我刚刚看了楼主的色谱图，主峰和杂质峰不能实现基线分离，如果你的分离度大于1.5，也是由于你设定的积分条件所致。
所以，我的意见是你并没有实现分离度合格，还要进一步改进分析方法。
个人理解，仅供参考。
帮楼主把图贴出来哈。
说实话，看过图谱后，觉得哪个都不咋样，分析条件还有待优化！
如果非要选择一个，还是左下、右上的合适点吧
（缩略图，点击图片链接看原图）
同意yukai4811的看法。中药成分复杂。所以做含量测定较难达到基线分离，但是分离度大于1.5是最起码的要求。否则方法的准确性就有问题，尤其做质量标准，送审时会被质疑。看楼主的图谱2（右上），不知放大了多少倍，感觉连基线都没有跑平。建议优化下色谱条件。可考虑以下几点：流动相组成；PH；流速；温度等等。
所言不全，其他战友补充！
看了你得原图，杂峰高2.5-10，基线下飘11，还是有点明显底，若下飘成一个凹陷表示你有东西没分开。不知你破坏试验有何要求。
改柱温有时很有效的哦。
改变积分条件，来达到分离，像你这样的图是不行的。 建议小小的改变下流动相比例再看看分离结果。
我觉得你的图谱根本没分开，可从前处理上作考虑，如离心，卒取等。也可用以上几位战友的方法。
我觉得你的图谱根本没分开，可从前处理上作考虑，如离心，卒取等。也可用以上几位战友的方法。
我觉得你的图谱根本没分开，可从前处理上作考虑，如离心，卒取等。也可用以上几位战友的方法。
同意picasso的意见。
楼主图谱的刻度放的很大了，如果条件不能优化，从理论上来说积分应该是两上顶点之间。同意左下右上。
简单的方法可更换相同填料的不同品牌的柱子试试，看这图可能只调节流动相组成；PH；流速；温度等很难达到理想的效果，解决的根本办法最好用梯度洗脱
非常感谢各位的热心帮助！
药物是３６个氨基酸组成的多肽，分子量4727，用过菲罗门、迪马和资生堂的C18色谱柱，一直没做到完全的基线分离，
多肽类药物还不同于中药，没有合适的前处理办法，附件里是部分图谱，后一图谱是前一图谱的局部放大，没完全显示的大峰是主峰。
还请大家多给些建议啊！
以前分析做的不多，实在是没办法了
部分图谱.rar (267.94k)
yanxw可以到这里学习如何贴图的，你现在这样贴附件让看帖子帮助你的战友稍微辛苦点的哈～～
>
也可以这样发图片的：
screen.width-333)this.width=screen.width-333" width=640 height=192 title="Click to view full 未命名1.JPG (717 X 216)" border=0 align=absmiddle>
这样的图一定是不行的,怎么说明你用这个方法的专属性,看起来好像峰太低基线都有些不稳.想办法调流动相
首先，友情提醒楼主协调好“求助”与“技术保密”之间的关系～～～
1、破坏性试验应该多数都是在新药研发阶段的吧。所以，界定楼主的问题是研发中遇到的，不是上市产品遇到的。
2、建议楼主以“原研药”的立场和思维方式来研究自己的药物，尽量抛弃仿制药的研究思路，这样也许会更利于你搞清顶楼提出的技术问题。
3、对于破坏性试验，可以和你的原料合成/生产工艺结合考虑的。你这个应该是有关物质研究项目中的内容吧？我们还是应该看看在合成/生产过程中，你都投入了哪些原料、加入了哪些催化剂、生成了哪些中间体，主成分合成/生产出来之后，容易发生哪些降解————这些角度来考虑！
4、从技术上考虑，我个人更喜欢采用等度洗脱来分析有关物质，在一个等度条件不能在适当的时间内将所有的杂质都检出时，我可以用两个条件，一个主药分析出峰快的、另一个主要用于分析出峰慢的。这样虽然说麻烦点，但是，其重现性应该是梯度洗脱不能比拟的。
5、建议楼主找到：“18种氨基酸注射液”的分析方法，用来参考，或许能够给你更多的灵感。
6、且，你是明确知道你的这36个氨基酸是什么的吧？你可以找到他们，用你设定的分析条件试试，看他们在你设定的条件种都是在多少的保留时间中出峰的。看他们能否与你的主峰良好分离。他们与你的主峰良好分离是很有帮助的。
7、当然，如果能够找到这36中氨基酸能够形成的各种多肽，同时进行对比分析就更好了。
8、说了些空话，没有实质性帮助。就是觉得你的条件还有待优化
有点麻烦哈？如果是作开创性的工作，这些麻烦是必须经历和承受的。
非常感谢"皮蛋"版主的指点和帮助!
实验有了一些进展,但还有一个问题不大明白,请各位再指点一下,多谢
样品:原料药和对照
左侧两个图是原料药的,右侧两个是对照的;上面两个图是同一梯度法测定的含量,下面的两个图是同一等度法测定的含量.
原料药的含量高,但在等度法中却没有出峰.两个样品用PBS助溶
等度法条件为:
色谱柱： phemomenex Gemini 5u 250×4.6mm
流动相： 10mmol PBS :乙腈 （80:20） pH 7.5
两个样品中PBS量不同,没测pH值
没出峰时因为样品在流动相里析出来吗
（缩略图，点击图片链接看原图）
随便copy了一份以前的参数：
流动相 A 水 0.1%TFA （10%甲醇）
B 乙腈 0.1%TFA（10%甲醇）
梯度 时间（min） 0-50 50-60
B% 40-50 50-40
流速1ml/min
进样量20ul
柱压10.4Mpa
和你现在的条件进行对比：
色谱柱： phemomenex Gemini 5u 250×4.6mm
流动相： 10mmol PBS :乙腈 （80:20） pH 7.5
两个样品中PBS量不同,没测pH值
认为：
你的新条件中，水相的比例太大。无法理解你的等度洗脱的对照能够出峰这么快？可是样品却不出来？
建议：
将水相：有机相的比例调换看看。
楼上结果如果具有重复性，表明不是“偶然”发生的，或许讨论的意义更大。
研究过程中，还是从有机相比例大的条件先开始，这样毕竟出峰时间短，得出结论快。然后，就可以根据情况调整比例的了。
另，你现在图谱上面的数据看不清，不好分辨保留时间、电压相应值的差异。建议下次搞清楚点的图谱看。
你的两个图基线应没跑好，现在也了解不够，不好意思
yanxw wrote:
样品:原料药和对照
左侧两个图是原料药的,右侧两个是对照的;上面两个图是同一梯度法测定的含量,下面的两个图是同一等度法测定的含量.
原料药的含量高,但在等度法中却没有出峰.两个样品用PBS助溶
这个图片我没有看懂
对照品梯度反而比等度出的峰少2个？有点奇怪
其实针对你的文中一开始的图，我认为在一定的量度范围下基线水平并且在一定的积分条件下可以稳定积分即可，任何一条基线在无限放大都不可能是很平的，片面追求那么完美的实验环境是不现实的，当然是在你现有可提供的稳定环境，如增加柱温箱，尽量使用双泵系统，外界环境的温度稳定，样品前处理等等
建议氨基酸的有关物质检查用柱前衍生法，还不错，就是前处理麻烦一点，主要是要考察一下衍生的比例及时间问题。
查过一些文献，氨基酸的衍生是能够检出的。
我们以前做过一个两种氨基酸的的，可能没有你的这么复杂，但我觉得思路应该是可行的。
yanxw wrote:
各位高人，做破坏实验时碰到一个问题，同一个图谱采用不同的积分方式，分离度不同，有的大于1.5，有的小于1.5，大家伙儿给看看，应该以哪个为准呢，先谢过了
针对分离度问题及色谱条件筛选，个人觉得以这个条件作为你的测定条件即可：
screen.width-333)this.width=screen.width-333" width=500 height=462 title="Click to view full 1.jpg (500 X 462)" border=0 align=absmiddle>
yanxw wrote:
非常感谢"皮蛋"版主的指点和帮助!
实验有了一些进展,但还有一个问题不大明白,请各位再指点一下,多谢
样品:原料药和对照
左侧两个图是原料药的,右侧两个是对照的;上面两个图是同一梯度法测定的含量,下面的两个图是同一等度法测定的含量.
原料药的含量高,但在等度法中却没有出峰.两个样品用PBS助溶
等度法条件为:
色谱柱： phemomenex Gemini 5u 250×4.6mm
流动相： 10mmol PBS :乙腈 （80:20） pH 7.5
两个样品中PBS量不同,没测pH值
没出峰时因为样品在流动相里析出来吗
1，参考皮蛋、longbow斑竹及各位站友的意见；如果样品中单个杂质小于你的检测限浓度量（假设0.05%），均可忽略不计；
2，在等度洗脱图谱中，对照品出峰原料不出峰，可能原因有：
A，原料和对照品前处理方法不一致；
B，原料浓度比对照品浓度小；
3，不知你的样品（原料）和对照品前处理方法是否一致？如果是一致，那么等度洗脱中，建议参考皮蛋斑竹的意见：将有机相比例增大试试；
4，在各条件下，不知楼主是否曾进过空白溶剂？比如PBS溶液是否出峰？先排除空白溶剂不干扰主峰测定因素；
5，没出峰时因为样品在流动相里析出来吗－－至于这个原因，我想，如果你的原料和对照品的处理方式一致，是不会出现对照品能出峰原料不出峰的现象，当然也就不会出现样品在流动相析出一说。
个人愚见，仅供参考。
longbow wrote:
这个图片我没有看懂
对照品梯度反而比等度出的峰少2个？有点奇怪
其实针对你的文中一开始的图，我认为在一定的量度范围下基线水平并且在一定的积分条件下可以稳定积分即可，任何一条基线在无限放大都不可能是很平的，片面追求那么完美的实验环境是不现实的，当然是在你现有可提供的稳定环境，如增加柱温箱，尽量使用双泵系统，外界环境的温度稳定，样品前处理等等
longbow兄的帖子让我想起了另外一件事情：如何设定基线放大的辈数问题。
建议：如果我们的样品溶液浓度为A，那么，配制一份A/100浓度的样品溶液，进样，调整衰减什么的，使得色谱主峰的高度占满度的大约1/2就差不多了。
后面测定样品时，纵坐标的放大倍数都控制如此。
picasso wrote:
longbow兄的帖子让我想起了另外一件事情：如何设定基线放大的辈数问题。
建议：如果我们的样品溶液浓度为A，那么，配制一份A/100浓度的样品溶液，进样，调整衰减什么的，使得色谱主峰的高度占满度的大约1/2就差不多了。
后面测定样品时，纵坐标的放大倍数都控制如此。
如picasso站友所言
其实相对于有关物质检测一般的自身对照法而言，自身对照溶液和供试品溶液的坐标一般都一致，在方法中通常都有规定，比如：
有关物质 取本品内容物适量，加流动相溶解并稀释制成每1ml中约含XXX1.0mg的溶液，滤膜滤过，作为供试品溶液；精密量取供试品溶液1.0ml，置100ml量瓶中，加流动相稀释至刻度，作为对照溶液。照含量测定项下的色谱条件试验，取对照溶液20µl注入液相色谱仪，调节仪器检测灵敏度，使主成分峰的峰高约为记录仪满量程的20%～30%，再精密量取对照溶液和供试品溶液各20µl，分别注入液相色谱仪，记录色谱图至主成份峰保留时间的3倍，供试品溶液如显杂质峰，杂质峰面积总和不得大于对照溶液主峰面积（1.0%）。
根据杂质大小、杂质峰和主峰的吸收强弱记录满量程的百分之几其实是可以变化的，如果杂质较多、吸收较强，图谱能明显区别杂质和主峰的话可以记录满量程的10～20%或10～30%均可。
需要说明的是，不管量程记录多少，在图谱中杂质峰和溶剂峰及主峰的分离度理应都是符合规定的。
提高分离度的方法无非有以下几种：
1.改变流动相（包括种类和比例）
2.调节柱温
3.加入一些能提高分离度的物质如三乙胺
4.降低流速如0.8ml/min
5.增加柱长度
6.更换不同型号的色谱柱
以上是我所能想到的，希望有所帮助。
lyslinjiu wrote:
如picasso站友所言
其实相对于有关物质检测一般的自身对照法而言，自身对照溶液和供试品溶液的坐标一般都一致，在方法中通常都有规定，比如：
有关物质 取本品内容物适量，加流动相溶解并稀释制成每1ml中约含XXX1.0mg的溶液，滤膜滤过，作为供试品溶液；精密量取供试品溶液1.0ml，置100ml量瓶中，加流动相稀释至刻度，作为对照溶液。照含量测定项下的色谱条件试验，取对照溶液20µl注入液相色谱仪，调节仪器检测灵敏度，使主成分峰的峰高约为记录仪满量程的20%～30%，再精密量取对照溶液和供试品溶液各20µl，分别注入液相色谱仪，记录色谱图至主成份峰保留时间的3倍，供试品溶液如显杂质峰，杂质峰面积总和不得大于对照溶液主峰面积（1.0%）。
根据杂质大小、杂质峰和主峰的吸收强弱记录满量程的百分之几其实是可以变化的，如果杂质较多、吸收较强，图谱能明显区别杂质和主峰的话可以记录满量程的10～20%或10～30%均可。
需要说明的是，不管量程记录多少，在图谱中杂质峰和溶剂峰及主峰的分离度理应都是符合规定的。
说明一下红色部分文字。
以前，人们多勇积分仪进行HPLC的峰面积测定的时候，我们常常提到这个概念：检测灵敏度。
现在，人们用工作站的时候，当然，检测器那边有些机器还是可以调节“检测灵敏度”的，不过，多数时候都应用的是工作站的本身的“纵坐标”、“横坐标”范围的设定这么一个东西了。
但是，人们往往在制定标准的时候，还是习惯采用上面小药丸朋友说的红色文字进行相关的描述。作为专业选手，我们还是应该明白这些文字的由来的。
另外，有的色谱系统在分析有关物质的时候，基线噪音不小，也许就会带来一些我们误认为是“有关物质”的积分出来。于是，有一种积分方式就有他的优势了。例如，配点1/10000样品浓度或者更低的浓度，进样测定，将这个测得的峰面积作为积分参数设定时的“最小峰面积”，基本可以克服掉好些基线噪音带来的偏差的了。
每当看到这种方法的时候，觉得十分的爽
偏了、偏了哈、离题了哈
picasso wrote:
说明一下红色部分文字。
以前，人们多勇积分仪进行HPLC的峰面积测定的时候，我们常常提到这个概念：检测灵敏度。
现在，人们用工作站的时候，当然，检测器那边有些机器还是可以调节“检测灵敏度”的，不过，多数时候都应用的是工作站的本身的“纵坐标”、“横坐标”范围的设定这么一个东西了。
但是，人们往往在制定标准的时候，还是习惯采用上面小药丸朋友说的红色文字进行相关的描述。作为专业选手，我们还是应该明白这些文字的由来的。
另外，有的色谱系统在分析有关物质的时候，基线噪音不小，也许就会带来一些我们误认为是“有关物质”的积分出来。于是，有一种积分方式就有他的优势了。例如，配点1/10000样品浓度或者更低的浓度，进样测定，将这个测得的峰面积作为积分参数设定时的“最小峰面积”，基本可以克服掉好些基线噪音带来的偏差的了。
每当看到这种方法的时候，觉得十分的爽
偏了、偏了哈、离题了哈
哦，原来还有这种做法，长见识了
不偏不偏，正中下怀
liangtg wrote:
提高分离度的方法无非有以下几种：
1.改变流动相（包括种类和比例）
2.调节柱温
3.加入一些能提高分离度的物质如三乙胺
4.降低流速如0.8ml/min
5.增加柱长度
6.更换不同型号的色谱柱
以上是我所能想到的，希望有所帮助。
流动相PH，柱子是否有污染需要清洗，梯度冲，基本上也就这些了。
感谢picasso 战友的发言，学习了。 还没在实际中感觉过。
楼主去哪了？
问题解决了？
衷心感谢楼上各位朋友的热心帮助!!!
实验还没有取得"质"的进展,很难达到完全的基线分离.
等度洗脱方法分析样品时,对照出峰了,原料药却没有出峰.
①进过空白溶剂,不出峰
②原料药的浓度高于对照
③增大有机相后，保留时间太短
④用PBS溶解样品后直接进样，没有其它的处理
⑤等度法中原料药没出峰，改用梯度法洗脱，出峰了，说明等度法中原料药在流动相中析出了
⑥流动相不能溶解原料药和对照，但对照却可以出峰
原料药和对照的区别就是PBS量不同，以前用梯度法分析样品时，PBS的量对分析结果几乎没有影响。
今天听领导说了一种方法感觉行不通，请各位分析一下：
他说以后生产时可以用等度法取代梯度法，只要等度法条件下样品与对照峰面积比和梯度法条件下样品与对照峰面积比一样，用等度法就可以不用对照。
在检测中间体含量时，不管是等度法还是梯度法，都应该用对照的吧
多谢指教！
yanxw wrote:
衷心感谢楼上各位朋友的热心帮助!!!
实验还没有取得"质"的进展,很难达到完全的基线分离.
等度洗脱方法分析样品时,对照出峰了,原料药却没有出峰.
①进过空白溶剂,不出峰
②原料药的浓度高于对照
③增大有机相后，保留时间太短
④用PBS溶解样品后直接进样，没有其它的处理
⑤等度法中原料药没出峰，改用梯度法洗脱，出峰了，说明等度法中原料药在流动相中析出了
⑥流动相不能溶解原料药和对照，但对照却可以出峰
原料药和对照的区别就是PBS量不同，以前用梯度法分析样品时，PBS的量对分析结果几乎没有影响。
今天听领导说了一种方法感觉行不通，请各位分析一下：
他说以后生产时可以用等度法取代梯度法，只要等度法条件下样品与对照峰面积比和梯度法条件下样品与对照峰面积比一样，用等度法就可以不用对照。
在检测中间体含量时，不管是等度法还是梯度法，都应该用对照的吧
多谢指教！
红色部分的这个想法有点大胆，容我细细想想
①进过空白溶剂,不出峰————恩
②原料药的浓度高于对照————究竟是什么样的比例关系？100：1？10：1？还是1000：1？
③增大有机相后，保留时间太短————列出几个具体的比例，具体的保留时间看看
④用PBS溶解样品后直接进样，没有其它的处理————确信是溶解了的？没有部分溶解的假相？
⑤等度法中原料药没出峰，改用梯度法洗脱，出峰了，说明等度法中原料药在流动相中析出了————直接用流动相来配制一下溶液，看看你的原料药在其中的溶解度是多少？溶解速度如何？如果已经作了，部分给电数据看看。
⑥流动相不能溶解原料药和对照，但对照却可以出峰————哦，看看是不是对照中的“杂质”成分溶解后的相应！！
我做化学药的,没有做过这么复杂的样品,我觉得你可以考虑优化一下洗脱程序,换一根碳覆盖率高的色谱柱试一试.走一针blank 扣除后基线也许会好一些.THF不是很稳定,本身吸收交大,最好用新开的THF.
yanxw wrote:
衷心感谢楼上各位朋友的热心帮助!!!
实验还没有取得"质"的进展,很难达到完全的基线分离.
等度洗脱方法分析样品时,对照出峰了,原料药却没有出峰.
①进过空白溶剂,不出峰
②原料药的浓度高于对照
③增大有机相后，保留时间太短
④用PBS溶解样品后直接进样，没有其它的处理
⑤等度法中原料药没出峰，改用梯度法洗脱，出峰了，说明等度法中原料药在流动相中析出了
⑥流动相不能溶解原料药和对照，但对照却可以出峰
原料药和对照的区别就是PBS量不同，以前用梯度法分析样品时，PBS的量对分析结果几乎没有影响。
今天听领导说了一种方法感觉行不通，请各位分析一下：
他说以后生产时可以用等度法取代梯度法，只要等度法条件下样品与对照峰面积比和梯度法条件下样品与对照峰面积比一样，用等度法就可以不用对照。
在检测中间体含量时，不管是等度法还是梯度法，都应该用对照的吧
多谢指教！
1，楼主不妨透露一下，你的是什么类型的药物？对照是直接购买的？还是原料的精制品？还是只是某药材的有效成分？－－从你提供的图谱来看，对照应该是一个单一成分的物质（但纯度好像不是很好），而原料是多成分的物质，不知是不是？（假设对照是原料药的精制品，其物理性质和化学性质应该是一致的，不可能出现在同一条件同法测定的条件下，其中一个不出峰的现象！！）
2，原料药的浓度高于对照－－假设按外标法计算，原料药和对照配制的浓度应该是一样的（有效成分），难道原料药的浓度高于对照，原料药就会出峰？－－如果是这样，那很有可能是你的原料药溶解度没有对照品的溶解度好导致！
3，增大有机相后，保留时间太短－－也就是说，增大有机相后，原料和对照都能出峰？只是保留时间太靠前？另外一个问题：此时用对照计算原料的含量是否与理论的含量结果一致？
4，等度法中原料药没出峰，改用梯度法洗脱，出峰了，说明等度法中原料药在流动相中析出了－－好像没有这种说法，至少我没有碰到过这种现象，提供几个验证方法试试：
A，分别用同一溶剂将原料药和对照品稀释制成适当浓度溶液进行紫外扫描，看看其最大吸收波长和吸收值是否成比例？
B，用最少量的溶剂将原料和对照溶解，再用流动相稀释至刻度（各一份），放置几个小时，观察原料药和对照品溶液是否有析出现象？
C，用梯度法和等度法中的溶剂分别对原料和对照品做一下溶解度试验看看，看其结果是否一致？
5，PBS的量对分析结果几乎没有影响－－别忽略了这个问题，最好分别采用不同的PBS量的溶液对原料和对照品进行配制、进样，看看其峰面积是否有增大现象？
6，他说以后生产时可以用等度法取代梯度法，只要等度法条件下样品与对照峰面积比和梯度法条件下样品与对照峰面积比一样，用等度法就可以不用对照。－－既然现在等度法试验中原料都没有色谱峰行为，何来“等度法条件下样品与对照峰面积比”之说？
yanxw wrote:
衷心感谢楼上各位朋友的热心帮助!!!
实验还没有取得"质"的进展,很难达到完全的基线分离.
等度洗脱方法分析样品时,对照出峰了,原料药却没有出峰.
①进过空白溶剂,不出峰
②原料药的浓度高于对照
③增大有机相后，保留时间太短
④用PBS溶解样品后直接进样，没有其它的处理
⑤等度法中原料药没出峰，改用梯度法洗脱，出峰了，说明等度法中原料药在流动相中析出了
⑥流动相不能溶解原料药和对照，但对照却可以出峰
原料药和对照的区别就是PBS量不同，以前用梯度法分析样品时，PBS的量对分析结果几乎没有影响。
今天听领导说了一种方法感觉行不通，请各位分析一下：
他说以后生产时可以用等度法取代梯度法，只要等度法条件下样品与对照峰面积比和梯度法条件下样品与对照峰面积比一样，用等度法就可以不用对照。
在检测中间体含量时，不管是等度法还是梯度法，都应该用对照的吧
多谢指教！
楼主提供的6点，感觉有点矛盾。
①进过空白溶剂,不出峰。
可以说明PBS不影响结果。但是楼主提到的“原料药和对照的区别就是PBS量不同”又不知是何意？
②原料药的浓度高于对照
有没有超载？
④用PBS溶解样品后直接进样，没有其它的处理
没有过膜？
⑤等度法中原料药没出峰，改用梯度法洗脱，出峰了，说明等度法中原料药在流动相中析出了
这个解释好像不通。跟你的③矛盾啊。一般进针都是微克级，这种级别在流动相中不溶，那你的色谱方法就有问题。而且，就算析出了，从压力上可以很明显的看出来。
梯度出峰，等度不出峰。这种现象很常见，我曾遇到过，在同一台液相同一柱子上怎么也作不出来，换了液相和柱子就作出来了，我也不知何故，不知楼主等度做不出来是不是偶然，有没有确证下。
所以，建议楼主换个柱子试试，选择合适的流动相比例，从③可以看出流动相还没有最优，至于出峰时间太短，可以考虑升高柱温，用长柱等方法。
另，领导的说法，个人以为不可行，看你领导怎么操作了。个人看法，请各位战友批评指正。
