载体主要有病毒和非病毒两大类,其中质粒DNA是一种新的非病毒转基因载体。
一、一个合格质粒的组成要素
复制起始位点Ori 即控制复制起始的位点。原核生物DNA分子中只有一个复制起始点。而真核生物DNA分子有多个复制起始位点。
抗生素抗性基因 可以便于加以检测，如Amp+ ,Kan+
多克隆位点MCS 克隆携带外源基因片段
P/E 启动子/增强子
Terms 终止信号
加poly（A）信号 可以起到稳定mRNA作用
二、如何阅读质粒图谱
第一步：首先看Ori的位置，了解质粒的类型（原核/真核/穿梭质粒）
第二步：再看筛选标记，如抗性，决定使用什么筛选标记。
（1）Ampr 水解β－内酰胺环，解除氨苄的毒性。
（2）tetr 可以阻止四环素进入细胞。
（3）camr 生成氯霉素羟乙酰基衍生物，使之失去毒性。
（4）neor（kanr） 氨基糖苷磷酸转移酶 使G418（长那霉素衍生物）失活
（5）hygr 使潮霉素β失活。
第三步：看多克隆位点（MCS）。它具有多个限制酶的单一切点。便于外源基因的插入。如果在这些位点外有外源基因的插入，会导致某种标志基因的失活，而便于筛选。决定能不能放目的基因以及如何放置目的基因。
第四步：再看外源DNA插入片段大小。质粒一般只能容纳小于10Kb的外源DNA片段。一般来说，外源DNA片段越长，越难插入，越不稳定，转化效率越低。
第五步：是否含有表达系统元件，即启动子－核糖体结合位点－克隆位点－转录终止信号。这是用来区别克隆载体与表达载体。克隆载体中加入一些与表达调控有关的元件即成为表达载体。选用那种载体，还是要以实验目的为准绳。
启动子－核糖体结合位点－克隆位点－转录终止信号
启动子－促进DNA转录的DNA顺序，这个DNA区域常在基因或操纵子编码顺序的上游，是DNA分子上可以与RNApol特异性结合并使之开始转录的部位，但启动子本身不被转录。
增强子/沉默子－为真核基因组（包括真核病毒基因组）中的一种具有增强邻近基因转录过程的调控顺序。其作用与增强子所在的位置或方向无关。即在所调控基因上游或下游均可发挥作用。/沉默子－负增强子，负调控序列。
核糖体结合位点/起始密码/SD序列（Rbs/AGU/SDs）：mRNA有核糖体的两个结合位点，对于原核而言是AUG（起始密码）和SD序列。
转录终止顺序（终止子）/翻译终止密码子：结构基因的最后一个外显子中有一个AATAAA的保守序列，此位点down－stream有一段GT或T富丰区，这2部分共同构成poly（A）加尾信号。结构基因的最后一个外显子中有一个AATAAA的保守序列，此位点down－stream有一段GT或T富丰区，这2部分共同构成poly（A）加尾信号。
回答有人之前提出的一个问题：为什么质粒图谱上有的箭头顺时针有的箭头逆时针，那其实是代表两条DNA链，即质粒是环状双链DNA，它的启动子等在其中一条链上，而它的抗性基因在另一条链上.
三、介绍一下关于载体的知识（虽然课本上都有写）
1. 什么是载体
即要把一个有用的基因（目的基因——研究或应用基因）通过基因工程手段送到生物细胞（受体细胞），需要运载工具（交通工具）携带外源基因进入受体细胞，这种运载工具就叫做载体（vector）。
P.S.基因工程所用的vector实际上是DNA分子，是用来携带目的基因片段进入受体细胞的DNA
2. 载体的分类
―――按功能分成：（1）克隆载体 都有一个松弛的复制子，能带动外源基因，在宿主细胞中复制扩增。它是用来克隆和扩增DNA片段（基因）的载体。（所以有时实验时扩增效率低下，要注意是不是使用的严谨行载体）
（2）表达载体 具有克隆载体的基本元件（ori,Ampr,Mcs等）还具有转录/翻译所必需的DNA顺序的载体。
―――按进入受体细胞类型分：（1）原核载体 （2）真核载体 （3）穿梭载体（sbuttle vector） 指在两种宿主生物体内复制的载体分子，因而可以运载目的基因（穿梭往返两种生物之间）.
P.S. 穿梭质粒含原核和真核生物2个复制子，以确保两类细胞中都能扩增。
3. 基因工程载体的3个特点：
（一）都能独立自主的复制：载体DNA分子中有一段不影响它们扩增的非必需区域，如MCS，插在其中的外源DNA片段，能被动的跟着载体一起复制/扩增，就像载体的正常成分一样。
（二）都能便利的加以检测： 如载体的药物抗性基因，多是抗生素抗性基因，将受体细胞放在含有该抗生素培养板上培养生长时，只有携带这些抗性基因的载体分子的受体细胞才能存活。
（三）都能容易进入宿主细胞中去，也易从宿主细胞中分离纯化出来。
4. 载体的选择和制备：
选择载体主要依据构建的目的，同时要考虑载体中应有合适的限制酶切位点。如果构建的目的是要表达一个特定的基因，则要选择合适的表达载体。
载体选择主要考虑下述3点：
【1】构建DNA重组体的目的，克隆扩增/表达表达，选择合适的克隆载体/表达载体。
【2】.载体的类型：
（1）克隆载体的克隆能力－据克隆片段大小（大选大，小选小）。如<10kb选质粒。
（2）表达载体据受体细胞类型－原核/真核/穿梭，E.coli/哺乳类细胞表达载体。
（3）对原核表达载体应该注意3点：
①选择合适的启动子及相应的受体菌；
②用于表达真核蛋白质时注意克服4个困难和阅读框错位；
③表达天然蛋白质或融合蛋白作为相应载体的参考。
【3】载体MCS中的酶切位点数与组成方向因载体不同而异，适应目的基因与载体易于链接，不产生阅读框架错位。
选用质粒（最常用）做载体的4点要求：
①选分子量小的质粒，即小载体（1－1.5kb）→不易损坏，在细菌里面拷贝数也多（也有大载体）；
②一般使用松弛型质粒在细菌里扩增不受约束，一般10个以上的拷贝，而严谨型质粒<10个。
③必需具备一个以上的酶切位点，有选择的余地；
④必需有易检测的标记，多是抗生素的抗性基因，不特指多位Ampr（试一试）。
无论选用哪种载体，首先都要获得载体分子，然后采用适当的限制酶将载体DNA进行切割，获得分子，以便于与目的基因片段进行连接。
顶一下
那么一个质粒从哪里开始读？
哪个是第一个碱基？哪个是最后一个?
楼上还问这问题啊，以前你的帖子有人回答了，从MCS的第一个碱基开始算1，但是不知道对否？
最近要做原核表达，已经连进PMD-18，不过不是从ATG开始的，不知道行吗？请高手指点，谢谢
最好从ATG开始呀,不然它都不是一个完整的蛋白了,在翻译;后折叠等个方面都会有影响的,特别是抗原性,您觉得呢,本来原核表达的蛋白就没真核的好,因为它缺少一个蛋白各种修饰的环境,你现在又不是一个完整的蛋白,当然象你这样做的人是很多的,但效果一般都不是很好
太好了，谢谢楼主哦!我刚好需要找这方面的东西，总结的很全面，令我受益匪浅！
正好对我有用!谢谢,收藏了
dna19830404 wrote:
正好对我有用!谢谢,收藏了
这贴也能得票啊？
顶！！！
不错，顶一下
把目的基因插入真核表达质粒PCDNA3.1(+)的MCS中，目的基因的前后还需要加上起始密码和终止密码子吗？
pcDNA3.1(+) and pcDNA3.1(-) are nonfusion vectors. Your insert must contain a Kozak
translation initiation sequence and an ATG start codon for proper initiation of translation
(Kozak, 1987; Kozak, 1991; Kozak, 1990). An example of a Kozak consensus sequence
is provided below. Please note that other sequences are possible (see references above),
but the G or A at position -3 and the G at position +4 are the most critical for function
(shown in bold). The ATG initiation codon is shown underlined.
(G/A)NNATGG
Your insert must also contain a stop codon for proper termination of your gene. Please
note that the Xba I site contains an internal stop codon (TCTAGA).
谢谢，收藏了
谢谢搂主的精彩总结！想请教1个问题是：看ori怎么区分质粒的类型呢？
谢谢楼主！对新手很有用呢。
谢谢楼主！对新手很有用呢。
好
有一定的参考价值，谢谢。
谢谢，收藏下！！
真的很不错!
顶一下
不是从ATG开始可能导致读码框架的改变，造成整个蛋白质的改变。
不是从ATG开始可能导致读码框架的改变，造成整个蛋白质的改变。
谢谢楼主了，顶！！！
谢谢，我是新手，对我们很有用
我正辛苦的寻找这方面资料呢.非常感谢.
谢谢，我也正在做这方面的内容，对我帮助很大。
谢谢楼主，非常有用！
谢楼主!
谢楼主!
非常有用！！！！
要是在表达载体中插入成熟肽片段不可能带有起始和终止密码子啊！难道非得在目的片段两端加上起始和终止密码子？
强烈建议编入教科书!
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