本人不久前在生物通上看见一个贴子：
随心所欲,玩转你的基因---基因置换、删除、插入、突变,一天完成
>
说基因置换，删除，插入，突变可以一天完成。
只不过价钱贵得很，本人一直从事这方面的工作，我们完成可以DIY嘛，大家干嘛再花这些冤枉钱呢？
下面将详细列出实验的进程，对于很多老手来说可能这根本不算什么，不过感觉可能会对一些人会有一定的帮助，也想自己加加分，就写了。^_^
网上也有其说明书，不过我看了之后，确实感觉它省略了很多实验细节，只说了个大概，对于很多新手来说，也说会是一头雾水，所以我就把我的心得写出来吧。
大家有什么疑问我们可以一起讨论讨论一下。
斑竹多给我加分啊，呵呵。
本贴先讲最简单的一个点的定点突变技术，其它较长片段的突变，删除，插入技术以后会慢慢奉上：
在做实验之前，我们首先要搞清楚实验的目的和实验的原理。
实验的目的应该比较明确吧：就是要把自己的基因上面的一个碱基换成另外一个碱基。一般情况下我们会有几种可能使我们需要这样去做：
第一：我们吊出来的基因有点突变，相信这可能是大家经常会遇到的问题。基因好不容易吊出来，并装进了自己的载体，却发现有一两个碱基跟自己的预期序列或所有的公共数据库不匹配，然后暴昏。
大家实验室里面还是用Taq酶为主吧，Pfu这样的高保真酶大家应该用得不多吧，Taq酶的优点和缺点都很明显：优点就是扩增效能强，缺点就是保真性差，其错配机率是比较高的，相关数字忘了，大家可以去网上查那个数字，不过感觉如果是2000bp的基因，如果扩四五十个循环的话，很大机率会出现点突变，当然这也跟具体PCR体系里的Buffer有很大关系，详细情况这里就不讨论了。
第二：要研究基因的功能，在基因上自己选定位置更换碱基的保守序列，或者改造成不同的亚型，总之就是要人工改造碱基序列符合自己的实验需要，相信这也是那些研究基因的人经常的一种思路吧。
对于第一种情况：我们首先要分析出现碱基不匹配的位置是不是重要的位置，如果不是很重要，大可不必管它，比如说是三联密码子的最后一位，碱基的改变并没有引起相应氨基酸的改变，那么一般情况下也可以不去理它。另外，在NCBI上人类的基因的版本一直在变化，也就是说同一个基因有不同的版本，或者称不同的亚型，其碱基序列有些许的差异，只要自己克隆出来的碱基序列与其中一个相匹配，一般也就可以不做定点突变了。如果有时间没钱，那干脆重新PCR然后再克隆进自己的载体了，不过最好换个保真性好一点的酶如PFU，或者PCR循环数低一点，不过这些东西有时候也得靠运气啦。实在不行的话再来做定点突变。
对于第二种情况：这种情况下一般也就只能做定点突变了。
接下来开始聊一聊定点突变的原理吧，那个Stratagene试剂盒！上面有一个说明书，说得好像很正规，不过上面好多都是什么专利啊什么注意之类的话，看都不看，我们简明扼要地只讲实验方面，通过设计引物，并利用PCR将模板扩增出来，然后去掉模板，剩下来的就是我们的PCR产物，在PCR产物上就已经把这个点变过来了，然后再转化，筛选阳性克隆，再测序确定就行了。
大家马上就会想到几个问题了：
第一：引物怎么设计呢？
第二：模板怎么去掉呢？
第三：怎么拿到质粒呢？
对于第一个问题：怎么设计引物？
我只能讲一些原则，并举一些例子。
引物设计的原则其它贴子上都有讲，这里就不重复了：
不过这种突变引物要加上一个原则：
一般都是以要突变的碱基为中心，加上两边的一段序列，两边长度至少为11-12base pair。
若两边引物太短了，很可能会造成突变实验失败，大家应该都知道，引物至少要11-12个base pair才能与模板搭上，而这种突变PCR要求两边都能与引物搭上，所以两边最好各设至少12个base pair，并且合成多一条反向互补的引物。
这么说大家可能不是很清楚，那我就举个例子吧：
X71661.1 TATCAGGAGGAATTTGAGCACTTTCAACAAGAATTGGATAAAAAAAAAGAGGAATTCCAG 960
现有序列 TATCAGGAGGAATTTGAGCACTTTCAACAAGAATTGGATAAAAAAAAAGAGGAATTCCAG 924
*********************************************** ************
|------>deletion
X71661.1 AAGGGCCACCCCGACCTCCAAGGGCAGCCTGCGGAGGAAATATTTGAGAGTGTAGGAGAT 1020
现有序列 AAGGGCCACCCCGACCTCCAAGGGCAGCCTGCGGAGGAAATATTTGAGAGTGTAGGAGAT 984
************************************************************
（上面为目的序列，下面为现有序列：我们发现有一个A碱基的缺失，其直接结果是在表达蛋白时后面的氨基酸全部错配）
我们以它为中心设计引物：两边各至少12个碱基，左边由于含有较多的A造成引物GC%含量过低，故拉长引物使GC%含量不至过低，也使引物退火温度升高。
故合成引物CAACAAGAATTGGATAAAAAAAAAGAGGAATTCCAGAAG
并合成反向互补引物CTTCTGGAATTCCTCTTTTTTTTTATCCAATTCTTGTTG
其实也不一定要反向互补序列，只要反向引物也是两边都有大于12个碱基，同时符合引物设计的原则就行了。
引物合成公司有很多家，大家可以去寻找，不同厂家的引物在价钱质量上有一些差别，不过价钱一般都是一块多一个碱基，合成时间约为一周。
这样的结果是PCR时把整个质粒都给扩出来了，得到的PCR产物是一条链完整，另一链有缺刻的PCR产物
对于第二个问题：
怎么去掉模板呢？再简单的方法就是用DpnI酶，DpnI能够识别甲基化位点并将其酶切，我们用的模板一般都是双链超螺旋质粒，从大肠杆菌里提出来的质粒一般都被甲基化保护起来（除非你用的是甲基化缺陷型的菌株），而PCR产物都是没有甲基化的，所以DpnI酶能够特异性地切割模板（质粒）而不会影响PCR产物，从而去掉模板留下PCR产物，所以提质粒时那些菌株一定不能是甲基化缺陷株，不会那么凑巧吧，哈哈。
关于第三个问题：
直接把通过DpnI处理的PCR产物拿去做转化就行了，呵呵，然后再筛选出阳性克隆，并提出质粒，拿去测序（这个就不用我多说了吧），验证突变结果，一般都没问题的啦，我做了几十个突变了，到目前为止还没有做不出来的，呵呵，不要砸我啊。
下面讲一下具体的实验步骤以及一些实验中要注意的事情：
1、 根据现有基因设计引物；
2、 合成引物并准备好模板；
3、 PCR，
4、 DpnI处理酶切产物；
5、 转化酶切产物；
6、 筛选 阳性克隆；
7、 送测序并测全长。
最后就是庆祝啦，呵呵，没什么复杂的。
引物和质粒都准备好后，当然就是做PCR喽，不过对于PCR的酶和buffer，不能用平时的，我们做PCR把整个质粒扩出来，延伸长度达到几个K，所以要用那些GC buffer或扩增长片段的buffer，另外，要用保真性能较好的PFU酶来扩增，防止引进新的突变。
那种Quick change试剂盒分为几种不同的类型
什么QuikChange® Site-Directed Mutagenesis Kit标准点突变试剂盒 、QuikChange® XL Site-Directed Mutagenesis Kit长模板单点突变试剂盒（>8kb）从原理上是一样的，只是PCR的酶和BUFFER不一样，后面用了比较适合长片段扩增的酶和BUFFER罢了，没什么特别的东西。
另外，DpnI处理的时间最好长一点，最少一个小时吧，最好能有两三个小时，因为如果模板处理得不干净，哪怕只有那么一点点，模板直接在平板上长出来，就会导致实验失败。
实验板长出来的菌有两种可能
一种是质粒DPNI没处理干净长出来的（模板），一种是PCR产物转化出来的
（突变体）
不过这两种菌长得一模一样^_^，即使提出质粒来也是一样（酶切和PCR都无法区分），除了测序，是分不出来的，
做PCR时也最好做一个负对照（不加引物），
实验管由于PCR时有引物，所以在DNPI处理前里面既含有模板又含有PCR产物，而对照管由于PCR时没放引物，所以在DPNI处理前里面只有模板。
如果两者都拿去DNPI处理
就能够证明模板已经被去除干净。
若实验顺利的话应该是：正对照长菌负对照不长菌。
如果出现正负对照都长菌，那么就是DpnI没处理好，
如果正负对照都不长菌，那么有两种可能，一种是PCR阴性，也就是说PCR出问题了，另外一个可能就是转化出问题了。要搞清楚是哪个问题，跑胶说明不了问题，那就做个转化的对照，拿试剂盒的对照实验去试感受态，马上就能知道转化有没问题。
如果正对照很多菌，负对照有几个菌，那么就是DPNI处理得不干净，这个时候就得靠运气了^_^
大家有什么问题我们可以继续讨论。
另外，如果大家既没有DpnI酶也没有好的PCR酶和BUFFER的话，那也有其它办法进行定点突变，只是麻烦一点，如果大家有需要的话，我会把方法贴上来。
对于多点突变技术及较长片段的缺失插入技术，同样的，如果大家有需要的话，我会把方法贴上来。
不过，如果你有钱的话，那就去买那个试剂盒吧，其中QuikChange® Site-Directed Mutagenesis Kit标准点突变试剂盒 、QuikChange® XL Site-Directed Mutagenesis Kit长模板单点突变试剂盒（>8kb）的原理我上面已经说了，只是补充了一些我认为的注意事项。如果你更有钱的话，那么你可以叫其它公司帮你做定点突变服务，大约是改一个点1000元左右。如果有需要我可以提供公司的联系方式。
好，强烈支持！
另外，如果大家既没有DpnI酶也没有好的PCR酶和BUFFER的话，那也有其它办法进行定点突变，只是麻烦一点，如果大家有需要的话，我会把方法贴上来。
对于多点突变技术及较长片段的缺失插入技术，同样的，如果大家有需要的话，我会把方法贴上来。
------------期待您的新贴!受益很多!
flyeye ：
你好，我最近也在做定点突变方面的工作，构建了近10个突变体。
但是主要用的是重叠PCR.
首先p两个片段，回收后在放在一起p.在回收连不带有酶切位点T载体，然后酶切/连接到原来载体。
虽然能做出来，但是却很烦琐！！！
我现在遇到的问题是：我最开始是用QuikChange®II Site-Directed Mutagenesis Kit做的。送去了一个
结果没有突变！
到现在也不知道问题在哪里。因引物长度也可以30bp，满足说明书上一切要求.
我现在遇到的问题是：我最开始是用QuikChange®II Site-Directed Mutagenesis Kit做的。送去了一个
结果没有突变！
dingo8369
您好：做点突变有三步最重要，其它的并不是很关键
第一点就是引物要设计好，也就是说要确保要突变的那个点在引物的中间，如果只是突变一个碱基，那么两边各15个BP那肯定没问题，如果是突变三四个碱基，那么两边 就要适当地加长，如加长到18个BP甚至更长。
第二点就是要PCR，如果PCR做不出来，那实验肯定失败，虽然PCR阳性的话跑胶并不一定能够跑出来，但是如果跑胶能跑出来的话那么肯定就是PCR阳性。一般情况下跑胶跑不出来也可能是因为循环数做得太少。一般情况下®II Site-Directed Mutagenesis Kit配的Turbo那个扩增酶保真性能挺好的，也是PFU酶嘛，所以循环数可以多一点没关系，二十五个应该没问题的，不会有新的点突变的。这样跑胶就能看出来阳性阴性。同时做PCR时要做负对照。
第三点就是DPNI处理了。这个不要说了，如果处理得不干净，那么模板质粒长出来，那么一测肯定就是没突变过来了。
dingo8369
我猜可能你是DPNI没处理好，我的建议是你取1uLPCR产物去做DPNI处理就行了（加上BUFFER和DPNI，最后体系10UL），早上放去酶切，下午两三点拿去转化，按我的经验它可以将PCR产物的模板去除得非常干净。
由于你说的不够具体，所以我不能做进一步的帮忙。
airforce8128 ：
你稍等一下吧，写这个挺费神的，我会尽快把它写出来的。
好的,我会耐心等待的,嘿嘿!
非常感谢！我也有个问题想请教！
我正在做大片段的多点突变。按照试剂盒说明操作，先PCR,得到带突变位点的长片段。以这个长片段为引物，以质粒为模板，本指望PCR出全质粒，但转化后却没有长菌落。将PCR产物跑胶也看不到任何质粒大小的条带，只有不太亮的引物条带（600BP）。
模板质粒在两个PCR反应中是一样的，第一个反应可以获得大量产物，在第二个PCR反应中，应该也没有问题。酶和BUFFER都是用的试剂盒里的。不知为什么得不到全质粒的扩增呢？是否长引物有影响？
请赐教！谢谢！
太感谢了！我最近也在做定点突变，我的序列有2000多bp，好不容易拉出来，却发生了突变，RT又重复不出来，快烦死了，实验室没有做定点突变的试剂盒 ，您能告诉我另一个方法吗？
你好，最近用试剂盒做突变，把通过DpnI处理的PCR产物拿去做转化，所用培养基是以氨苄为抗生素吗？
lxylly
你好，最近用试剂盒做突变，把通过DpnI处理的PCR产物拿去做转化，所用培养基是以氨苄为抗生素吗？
你好：这个不一定是以氨苄为抗生素的。
你原先拿什么质粒做PCR的模板的呢？
这个质粒是什么抗性，那么转化用的平板就是什么抗性。
突变试剂盒只是在质粒上面做小修小补，而且主要也是针对里面基因的。
所以一般不会改变到质粒载体的抗性。
美玉
太感谢了！我最近也在做定点突变，我的序列有2000多bp，好不容易拉出来，却发生了突变，RT又重复不出来，快烦死了，实验室没有做定点突变的试剂盒 ，您能告诉我另一个方法吗？
正如dingo8369所说：
“你可以重叠PCR.
首先p两个片段，回收后在放在一起p.在回收连不带有酶切位点T载体，然后酶切/连接到原来载体。
虽然能做出来，但是却很烦琐！！！”
我也经常会设计含有typeII 酶的引物来连接这两个片段，从而完成点突变，同时这也是拼接两个片段的常用方法，现在太晚了，我没办法详细写出来，下次吧。不过我不建议你使用这种方法，这种方法一般是针对大片段的缺失或插入而采用的方法，在设计引物时还要考虑到相应的TYPEII酶切信息，也要买TYPEII酶。
我的建议是不要用这种方法去做定点突变，还是用DpnI的方法去做定点突变，比较容易操作，引物设计也简单。去买小包装的DpnI酶，然后自己设计引物用PFU酶去做定点突变，一个点一个点地去改吧，除非你有多点突变试剂盒，里面含有那个特殊的taqligase类的东东。如果还有什么具体问题你也可以再具体讨论。
快乐无忧：
非常感谢！我也有个问题想请教！
我正在做大片段的多点突变。按照试剂盒说明操作，先PCR,得到带突变位点的长片段。以这个长片段为引物，以质粒为模板，本指望PCR出全质粒，但转化后却没有长菌落。将PCR产物跑胶也看不到任何质粒大小的条带，只有不太亮的引物条带（600BP）。
模板质粒在两个PCR反应中是一样的，第一个反应可以获得大量产物，在第二个PCR反应中，应该也没有问题。酶和BUFFER都是用的试剂盒里的。不知为什么得不到全质粒的扩增呢？是否长引物有影响？
请赐教！谢谢！
不好意思，拿600bp的条带当引物去做PCR我没有做过，你应该是PCR没做出来，我觉得你做PCR时的退火温度可以认真考虑一下，做个梯度PCR吧，它跟模板质粒能搭上多少碱基呢？这些碱基的TM值是多少呢，好好计算一下，再做一次PCR，PCR可以做多几个循环，PFU保真性能挺好的。
PCR有时候很奇怪的，你要多摸索摸索一下条件，引物的设计也很关键，加模板的量也很讲究，有时加多了就做不出来了，把模板稀很可释十倍看看，一般有二三十纳克就很足够了。
不知道这样回答你们满不满意。
刚看到flyeye的精华贴，感觉受益匪浅。我也正在做点突变，用的是赛百盛公司的试剂盒，做对照没有问题，但做自己序列的点突变却不顺利。具体情况如下，公司的技术支持建议我先用别的高保真酶进行PCR，以确定能否能扩增出目的片段，如果没有问题再用试剂盒中的试剂进行操作。问题就出在了这里，我买了一只宝生物的pyrobest高保真酶，可是做了十来次也没扩增出目的片段，因我的片段GC含量高（66.7%)，考虑可能会有二级结构，所以又加入DMSO，可是并无改观。我的引物大概是30个碱基，突变点在第16位，也应该没什么问题吧。为什么扩不出来呢？真烦人！另外，还有一个顾虑，会不会在PCR过程中又引入新的突变呢？这种几率大吗？期待您的回帖指导！谢谢！
grzhangjing:
您好，
我感觉你应该是PCR方面出了问题：
你PCR之后跑胶有没有看到条带呢？你转化之后是不是没有长菌呢？
我估计是PCR根本就没有做出来。
所以我的建议是调整你的PCR，看看引物有没有问题啦，看看模板质粒多长啊？你用的是什么BUFFER啊，你多少个循环啊？你的退火温度是多少啊？这些都有可能影响到PCR结果。
我的引物大概是30个碱基，突变点在第16位，也应该没什么问题吧。
首先我觉得你突变一个点用三十个碱基在引物长度方面应该是没有问题的，一般都要求在定点突变的两端至少要有十二个碱基。其它的只要你符合引物设计的最基本原理就行了，当然，我没看到你的引物序列，我也不敢就引物方面给出什么建议。
公司的技术支持建议我先用别的高保真酶进行PCR，以确定能否能扩增出目的片段，如果没有问题再用试剂盒中的试剂进行操作。
由于一般单点突变的试剂盒是把整个质粒都扩出来的，而质粒的长度一般都比较长，所以一般试剂盒会提供比较好的PCR酶和BUFFER，像TURBO就挺不错，非常好的扩增酶，扩增能力强而且保真性能好。只不过像TURBO这样扩增能力强而且保真性能好的酶一般比较贵。扩增能力和保真能力似乎是一对矛盾，一般酶要么扩增能力强而保真性能差像TAQ，要么保真性能强而扩增能力弱像PFU，所以有可能出现要么扩不出来，要么扩出来保真性能差的现象。所以公司技术支持的意见是对的：
要先把PCR做出来，这时就不必过于强调保真性能，镁离子多一点，循环数多一点都无所谓，先把它P出来，然后再优化PCR条件，提高其保真性能。
其实那个试剂盒里面就PCR酶和BUFFER好一点而已，再加上一点DPNI酶，其实这两个东西单买的话都不贵啊。
还有一个顾虑，会不会在PCR过程中又引入新的突变呢？这种几率大吗？期待您的回帖指导！
有可能出现这种机率，这要看你做PCR时的体系了，酶啊，BUFFER啊
不过如果你最后用的是试剂盒里面的BUFFER和酶，那么这种概率很小，小到我做了几十个才引进过一次新的突变，运气不会那么差吧，PFU酶配上比较好的BUFFER保真性能还是不错的。
你提供的信息有限，我也只能帮你分析到这里了。
看了flyeye的帖子受益匪浅。
我现在准备做定点突变有些问题想请教一下。我准备改造的目的片断大约600BP,两端各有一个突变点，在所设计引物的中间，突变点的两头各有12个左右碱基。现在准备用已经将含目的片断连在载体上的质粒为模板，用高保真Extap直接用两个突变引物P,然后不用DPNI去甲基化，直接进行筛选。
突变率多大，我看到一些文献这样直接转化成功了。
可行性怎么样啊，望指教！
谢谢。
sahara81你好，
其实突变只不过是用引物上的序列代替质粒上的序列，其实DNPI的优点就在于可以用引物把整个质粒都扩出来，然后再转化得到突变体，从而避免了把PCR产物亚克隆进载体（如酶切连接）的麻烦事而已。
你是打算PCR后再把PCR产 物克隆进载体吧，这个完全可以不用DPNI处理的，其实DNPI只是去除模板质粒罢了，如果你的模板不是质粒，那么根本就用不到DPNI。如果模板是质粒的话，你可以利用胶回收去除模板质粒或者把PCR产物克隆进其它抗性的载体然后通过抗性筛选 来去除模板质粒。
我准备改造的目的片断大约600BP,两端各有一个突变点，在所设计引物的中间，突变点的两头各有12个左右碱基。
其实我的建议是突变点尽量靠近引物的5端，因为3端的引物主要是与模板配对的，而5端的引物才是主要的人工改造（如加酶切位点啊突变啊）部分，不过如果在突变点的后面还有十二个碱基的话，应该没有问题。
现在准备用已经将含目的片断连在载体上的质粒为模板，用高保真Extap直接用两个突变引物P,然后不用DPNI去甲基化，直接进行筛选
听得不是很明白，PCR后把PCR产物直接拿去转化？600bp的PCR产物是长不出来的，长出来的也是模板的那些东东。
应该PCR后把它连接进载体后再拿去转化，如果是连回原来的那个载体，那么PCR后记得胶回收去除模板，如果是连回其它抗性的载体，则不用胶回收，直接连接后转化就行了。
谢谢flyeye的指导，新手还是有些不明白。
1 关于DPNI的具体作用能说明白点么？我一直以为它就去甲基化作用，处理后的PCR产物再进行筛选的话减少假阳性的。“DNPI的优点就在于可以用引物把整个质粒都扩出来，然后再转化得到突变体“ 不是很明白？
2 "听得不是很明白，PCR后把PCR产物直接拿去转化？600bp的PCR产物是长不出来的，长出来的也是模板的那些东东。"
我是准备PCR后把产物连接进载体后再拿去转化的。
3 以下是我的实验方案，帮我看看是否合理
提取菌液中含目的片段质粒（目地片断是连在载体上保存在菌中的），然后以提取的质粒为模板，两突变引物，Extap进行PCR，之后胶回收PCR产物（含两个突变点），将回收产物连在T载体，酶切鉴定，送测序。然后再转入表达载体，进行蛋白表达。
再次表示感谢。
呵呵，讨论得很热烈呀，本人也有定点突变PCR的长久实战经验。曾在一个18Kb的质粒上一次导入3个位点。
modernsky一起参与阿。
给我们这些新手些指导。
sahara81你好
1 关于DPNI的具体作用能说明白点么？我一直以为它就去甲基化作用，处理后的PCR产物再进行筛选的话减少假阳性的。“DNPI的优点就在于可以用引物把整个质粒都扩出来，然后再转化得到突变体“ 不是很明白？
其实我们实验的方法很不一样，我介绍的是依赖于DPNI酶的方法，就是通过引物在质粒上做小修小补，没有改变载体的性质。所以要依赖于DPNI酶，在整个实验中我并不需要引进限制性酶切位点，也没有酶切连接的过程，只是用PCR把整个质粒都给扩了出来，而我想改变的点就已经在引物上变过来了，如此而已，这 是一种懒人的做法，也可以加速实验的进程。其特点就是没有改变质粒的其它任何地方，只是改变了那一两个点而已。
此时PCR产物和模板质粒的长度是差不多的，所以不可能通过胶回收的方法来去除模板质粒，PCR产物和模板质粒也只有一两个点的差异，也不可能通过抗性筛选 来区分它们，所以只能通过模板质粒在大肠杆菌中已经甲基化而PCR产物没有甲基化这个区别，用DPNI识别甲基化位点再把模板质粒消化掉而已。
而你不仅变动了那两个点，而且连载体也一起变了，当然就要涉及到酶切连接的过程，这个时候你有很多方法去除模板质粒，蓝白班，抗性筛选 ，胶回收，根本就不需要用到DPNI酶。
2 "听得不是很明白，PCR后把PCR产物直接拿去转化？600bp的PCR产物是长不出来的，长出来的也是模板的那些东东。"
我是准备PCR后把产物连接进载体后再拿去转化的。
这个没问题，我误会了你的意思了。
整个实验方案我觉得没什么大的问题，祝你实验顺利。
下面我以一个例子为例来讲100个bp以下的碱基插入缺失或者改变实验方案。其实这种方案并不是那么好的，只不过考虑到大家一般都没有TYPEII限制性内切酶或者UDG and NTHIII（另外两种方法），所以才打算先介绍这种方法。
首先先说明一点，这种 方法在原理上存在一定成功机率，也就是说有运气成分。而定点突变则一般都是百分之百成功的，而这种100bp以下的插入缺失或者碱基改变可能要测几个克隆才能挑到一个好的克隆，大家如果要用请慎重考虑。
同样的，我只变那几十个碱基，并没有改变载体及其它地方，所以我还是依赖于DPNI酶。
举例：
Homo sapiens FzE3 是一个人类基因，其含有32个氨基酸的信号肽MRDPGAAAPLSSLGLCALVLALLGALSAGAGA，后面是成熟肽QPYHGEKGISVPDHGFCQPISIPLCTDI
AYNQTILPNLLGHTNQEDAGLEVHQFYPLVKVQCSPELRFFLCSMYAPVCTVLDQAIPPC
RSLCERARQGCEALMNKFGFQWPERLRCENFPVHGAGEICVGQNTSDGSGGPGGGPTAYP
TAPYLPDLPFTALPPGASDGRGRPAFPFSCPRQLKVPPYLGYRFLGERDCGAPCEPGRAN
GLMYFKEEERRFARLWVGVWSVLCCASTLFTVLTYLVDMRRFSYPERPIIFLSGCYFMVA
VAHVAGFLLEDRAVCVERFSDDGYRTVAQGTKKEGCTILFMVLYFFGMASSIWWVILSLT
WFLAAGMKWGHEAIEANSQYFHLAAWAVPAVKTITILAMGQVDGDLLSGVCYVGLSSVDA
LRGFVLAPLFVYLFIGTSFLLAGFVSLFRIRTIMKHDGTKTEKLEKLMVRIGVFSVLYTV
PATIVLACYFYEQAFREHWERTWLLQTCKSYAVPCPPGHFPPMSPDFTVFMIKYLMTMIV
GITTGFWIWSGKTLQSWRRFYHRLSHSSKGETAV，想在信号肽和成熟肽之间插入一个FLAG标签并在标签前面加上一个Leucine。即在信号肽和成熟肽之间插入一段序列：TTAATGGACTACAAAGACGATGACGACAAG（一共三十个bp）
实验设计：
信号肽：
ATGCGGGACCCCGGCGCGGCCGTTCCGCTTTCGTCCCTGGGCTTCTGTGCCCTGGTGCTG
GCGCTGCTGGGCGCACTGTCCGCGGGCGCCGGGGCG
成熟肽：
CAGCCGTACCACGGAGAGAAGGGC
ATCTCCGTGCCGGACCACGGCTTCTGCCAGCCCATCTCCATCCCGCTGTGCACGGACATC
GCCTACAACCAGACCATCCTGCCCAACCTGCTGGGCCACACGAACCAAGAGGACGCGGGC
CTCGAGGTGCACCAGTTCTACCCGCTGGTGAAGGTGCAGTGTTCTCCCGAACTCCGCTTT
TTCTTATGCTCCATGTATGCGCCCGTGTGCACCGTGCTCGATCAGGCCATCCCGCCGTGT
CGTTCTCTGTGCGAGCGCGCCCGCCAGGGCTGCGAGGCGCTCATGAACAAGTTCGGCTTC
CAGTGGCCCGAGCGCCTGCGCTGCGAGAACTTCCCGGTGCACGGTGCGGGCGAGATCTGC
GTGGGCCAGAACACGTCGGACGGCTCCGGGGGCCCAGGCGGCGGGCCCACTGCCTACCCT
ACCGCGCCCTACCTGCCGGACCTGCCCTTCACCGCGCTGCCCCCGGGGGCCTCAGATGGC
AAGGGGCGTCCCGCCTTCCCCTTCTCATGCCCCCGTCAGCTCAAGGTGCCCCCGTACCTG
GGCTACCGCTTCCTGGGTGAGCGCGATTGTGGCGCCCCGTGCGAACCGGGCCGTGCCAAC
GGCCTGATGTACTTTAAGGAGGAGGAGAGGCGCTTCGCCCGCCTCTGGGTGGGCGTGTGG
TCCGTGCTGTGCTGCGCCTCGACGCTCTTTACCGTTCTCACGTACCTGGTGGACATGCGG
CGCTTCAGCTACCCAGAGCGGCCCATCATCTTCCTGTCGGGCTGCTACTTCATGGTGGCC
GTGGCGCACGTGGCCGGCTTCTTTCTAGAGGACCGCGCCGTGTGCGTGGAGCGCTTCTCG
GACGATGGCTACCGCACGGTGGCGCAGGGCACCAAGAAAGAGGGCTGCACCATCCTCTTC
ATGGTGCTCTACTTCTTCGGCATGGCCAGCTCCATCTGGTGGGTCATTCTGTCTCTCACT
TGGTTCCTGGCGGCCGGCATGAAATGGGGCCACGAAGCCATCGAGGCCAACTCGCAGTAC
TTCCACCTGGCCGCGTGGGCCGTGCCCGCCGTCAAGACCATCACTATCCTGGCCATGGGC
CAGGTAGACGGGGACCTGCTGAACGGGGTGTGCTACGTTGGCTTCTCCAGTGTGGACGCG
CTGCGGGGCTTCGTGCTGGCGCCTCTGTTCGTCTACTTCTTCATAGGCACGTCCTTCTTG
CTGGCCGGCTTCGTGTCCTTCTTCCGTATCCGCACCATCATGAAACACGACGGCACCAAG
ACCGAGAAGCTGGAGAAGCTCATGGTGCGCATCGGCGTCTTCAGCGTGCTCTACACAGTG
CCCGCCACCATCGTCCTGGCCTGCTACTTCTACGAGCAGGCCTTCCGCGAGCACTGGGAG
CGCACCTGGCTCCTGCAGACGTGCAAGAGCTATGCCGTGCCCTGCCCGCCCGGCCACTTC
CCGCCCATGAGCCCCGACTTCACCGTCTTCATGATCAAGTGCCTGATGACCATGATCGTC
GGCATCACCACTGGCTTCTGGATCTGGTCGGGCAAGACCCTGCAGTCGTGGCGCCGCTTC
TACCACAGACTTAGCCACAGCAGCAAGGGAGAGACCGCGGTATGA
插入序列
TTAATGGACTACAAAGACGATGACGACAAG
通过引物3端大于或等于18个碱基的匹配使引物与模板质粒搭配，再通过引物5端的序列来补上那三十个碱基，先用PNK酶把引物磷酸化，再用下面这两条引物把整个质粒给扩增出来，上游和下游引物就刚好把那三十个碱基给补上了，再参照引物的设计原则做一些润色，细心的朋友可以具体分析一下这两条引物。扩出来后再用DPNI酶把模板质粒去掉，再用连接酶把PCR产物的两端连接起来（虽然是平端连接 ，可是由于是同一条PCR产物的两端连接，效率会很高），转化后，测序验证，OK。
设计引物
forward primer:GGACTACAAAGACGATGACGACAAGCAGCCGTACCACGGAGAGAAG
88.5
reserve primer: ATTAACGCCCCGGCGCCCGCGGACAGT
86.9
但是由于引物的合成是由3端向5端合成，而且每合成多一个碱基的效率最多也是百分之九十九点几而不是百分之一百，所以我们拿到手的引物其实是一个混合物，比如说我们合成一条长二十个碱基的引物，实际上拿到手的是一个混合物，里面即含有二十个碱基的引物，也含 有一定比率的十九个、十八个、十七个……碱基的引物。
所以我们用这种方法做PCR时，如果连上的是足额长度的引物，那么实验也就成功了，如果连上的是少一两个碱基的引物，那么实验就失败了，不过引物当中主要的仍是足额长度的引物，所以成功机率还是蛮高的。不过送测序时就要做好准备，可能要测三五个才能拿到一个好的。
如果觉得这样不好的话，我稍后会附上用TYPEII酶或者UDG，NTHIII做的方法，它们是通过互补粘端来连接，就不存在这个问题。
下面附上详细实验过程：
第一步：设计引物；其实只要符合一般引物设计原理就行了，顺便说一下，引物一般的话，越长其质量就…………
第二步：引物PNK处理，一般合成的引物其三端是没有磷酸化的，所以我们要自己进行磷酸化，一般可以让其磷酸化过夜，不磷酸化的话最后一步连接就连不上哦。
第三步：PCR，跟基因定点突变一样，要用好的扩增酶和BUFFER，因为要把整个环高保真的圹增出来嘛；
第四步：DPNI处理，跟基因定点突变一样，要把模板去除干净。
第五步：连接，加上连接BUFFER和连接酶连接，
第六步：转化。
OK
大家如果有什么疑问，我们可以一起继续讨论。
谢谢flyeye.
我们做突变是买的stratagene的pfu turbo酶，DPN1酶用NEB或PROMEGA的就可以了，根本没必要买试剂盒。而且做PCR的反应体系用25ul就可以了，拿出10微升跑胶观察，15微升用DPN1酶切3h，取4ul转化就可以了。最长的缺失突变做过1600bp的，完全没有问题。
同意gre007的看法，所以我没买过试剂盒，Turbo我也没买，我是用自己实验室纯化出来的Phusion，DPNI正在打算看能不能自己纯化出来，PCR反应体系25UL，取一微升去DPNI酶切就行了，补水补至10微升去切。转化取三四微升就行了。
对于插入突变来说，想把一段序列去掉是容易的事，至于这段序列是多长，是1600bp，还是10bp或者3000bp，其实做法都是一样的。比较麻烦的是要把一段比较长的序列补上去。
相当相当赞！！！！！！！！
深刻感谢LZ
谢谢！
请问,哪位能给解释一下随机突变试剂盒是怎么回事,我最近在做芽孢杆菌的转座子的随机突变库,遇到很多麻烦,不知能否用上这个试剂盒??????????
随机突变试剂盒就是通过PCR来引入新的随机突变，
虽然都是通过PCR反应来引入突变，但是二者有很大区别：
基因定点突变是带有目的性的，例如：我要把某个碱基变掉，我要把某段序列删掉；而随机突变是随机的，也就是说实验后究竟变了哪个碱基我们在做实验前无法预测，只能通过测序去看结果。这是研究蛋白的两种不同的方法。
其实主要通过降低PCR反应的保真性来增加PCR反应的突变来达到引入新的随机突变。
本人没有做过这方面实验，故无法发表更多评价，不过感觉上这种试剂盒应该也可以DIY的。
附上随机突变试剂盒说明书
随机突变.pdf (185.07k)
楼主您好！
我感觉做短片断的定点突变，是否是先把目的片断定点突变好后，然后再连入载体好些呢？我的感觉是，要是整个质粒太大，用再好的酶，也难保PCR扩增的保真性。因为虽然好多公司制作出了号称扩增多少个kb也没有突变的酶，但是在实际操作中，我们会发现，这些酶的保真性并没有想象那么好。
另外，在您所讲的方法之后测序时，测序会比较麻烦，因为要测整个质粒的序。
我的方法是：
1.设计定点突变的引物
2.扩增目的片断
3.目的片断和质粒的双酶切
4.双胶连
5.转化
6.鉴定
my1978：
你好：其实你这样是完全可以的啊，另外一种思路。
我这样做的好处是快和方便，基本上当天可以做转化。
至于保真性能：我们也可以不用太过担心：
因为定点突变（第一种方法）的PCR反应根本就不是一个PCR反应：
你可以画图：在模板变性后，互补反向引物分别与模板的两条链退火，然后延伸，完成第一次扩增后，其扩增产物是一条链完整（模板）另外一条链带有切刻（扩增产物）的环。之后第二次变性后，一条链完整（模板）和另外一条链带有切刻（扩增产物）分开，一条链完整（模板）能够与引物搭上继续下一步反就，而另外一条链带有切刻（扩增产物）则因为带有切刻无法延伸。接下去…………
总之，只有模板的两条链能够做为模板被扩增，而PCR出来的链切由于带有切刻而无法做为模板进行下一步的扩增，所以它根本就不是一个指数增长的PCR过程，而是一个线性增长的过程，只有做为模板的两条链（不会错配）被反复扩增，而不会出现平时PCR反应里面的错配被不断叠加的情况，从而大大降低了出现突变的可能性，从原理上大大提升了反应的保真性能，再加上高保真的PFU酶，总不会只扩增一个循环就突变了吧，也有这个可能，但机率很小。
extension time一般设多长？
我的8Kbp，是不是就要8min？
这个根据你的PCR酶而定，说明书上写多少就是多少。
my1978：
你好：其实你这样是完全可以的啊，另外一种思路。
我这样做的好处是快和方便，基本上当天可以做转化。
至于保真性能：我们也可以不用太过担心：
因为定点突变（第一种方法）的PCR反应根本就不是一个PCR反应：
你可以画图：在模板变性后，互补反向引物分别与模板的两条链退火，然后延伸，完成第一次扩增后，其扩增产物是一条链完整（模板）另外一条链带有切刻（扩增产物）的环。之后第二次变性后，一条链完整（模板）和另外一条链带有切刻（扩增产物）分开，一条链完整（模板）能够与引物搭上继续下一步反就，而另外一条链带有切刻（扩增产物）则因为带有切刻无法延伸。接下去…………
总之，只有模板的两条链能够做为模板被扩增，而PCR出来的链切由于带有切刻而无法做为模板进行下一步的扩增，所以它根本就不是一个指数增长的PCR过程，而是一个线性增长的过程，只有做为模板的两条链（不会错配）被反复扩增，而不会出现平时PCR反应里面的错配被不断叠加的情况，从而大大降低了出现突变的可能性，从原理上大大提升了反应的保真性能，再加上高保真的PFU酶，总不会只扩增一个循环就突变了吧，也有这个可能，但机率很小。
谢谢~~~受益匪浅!! 点突变也做过三十几个，用的全是Stratagene试剂盒。
现把遇到的问题和解决的办法拿出来与大家共享：
1.设计引物flyeye大哥说得很清楚了，就不多说了！
2.不管什么方法，pcr是关键，所以pcr的成功与否关键到实验的成败！引物和模板拿到后，个人建议跑琼脂糖胶做个检测，pcr时心里就有底了。
3.PCR时顺利则好，若出现问题，可考虑设置两个退火温度或者用梯度pcr ，相应增加循环数。
4.如果pcr折腾了好长时间没结果，那我建议根据质粒大小，换个载体（一般选择小的克隆载体）再p，就是说需要做一轮亚克隆。之后再继续，完了还要换回到原来的载体。或者用其他点突变的方法。
5.若pcr电泳条带特亮，那说明你的实验成功了一大半，剩下的只要不出小问题就ok了。
很重要的问题：
这样拿到的突变测序，一般只有目的片断的报告，载体总觉得不放心，因为如果载体的某个重要位点发生突变而影响了后面的一系列实验，那我只有买彩票去了啊!!! 大家讨论下有好的（省时省力）解决办法吗？？
