是不是细胞在处理过程中皱缩了呢？
我自己染过内皮细胞的荧光照片，虽然不甚清晰，但是基本上看的到核的部分是没有染色的
这个是vWF，二抗是TR
（缩略图，点击图片链接看原图）
***人在分离EPC的方法上有所改进.他们不用FICOLL分离了,自己搞了个过滤装置,大家看看.努力啊,否则,一直跟在别人屁股后面跑.
Unique Identifier 15536190
Authors Aoki M. Yasutake M. Murohara T.
Institution Department of Cardiology, Nagoya University Graduate School of Medicine, 65 Tsurumai, Showa-ku, Nagoya 466-8550, Japan.
Title Derivation of functional endothelial progenitor cells from human umbilical cord blood mononuclear cells isolated by a novel cell filtration device.
Source Stem Cells. 22:994-1002, 2004.
Abstract Endothelial progenitor cells (EPCs) can differentiate from mononuclear cells (MNCs) of adult human peripheral blood, bone marrow, and cord blood during culture. Although MNCs are usually isolated by a Ficoll gradient centrifuge method, this method is time-consuming, and blood is easily contaminated. We developed a novel cell filtration device (StemQuickE, Asahi Kasei Medical, Oita, Tokyo, Japan) to isolate MNCs from human cord blood and examined whether functional EPCs could differentiate from MNCs isolated by this device. Recovery rates of MNCs, CD34(+) and CD133(+) progenitor cells, were significantly greater in the StemQuickE method than in the Ficoll method. During MNC culture, spindle-shaped attaching cells developed, and most of these cells incorporated DiI-acetylated low-density lipoprotein and showed positive binding to fluorescein isothiocyanate-lectin. Reverse transcription-polymerase chain reaction analysis revealed that attaching cells expressed various progenitor and endothelial lineage markers such as KDR, CD31, endothelial cell nitric oxide synthase, CD133, and LOX-1. Culture-expanded EPCs were isolated and labeled with a green fluorescent dye, PKH2-GL, and cocultured with human umbilical vein endothelial cells (HUVECs). EPCs formed angiogenesis-like networks together with HUVECs in 3D matrix gel. Finally, EPCs (3 x 10(5)) were implanted into ischemic hindlimb of nude rats (n = 3), and laser Doppler blood flowmetry (LDBF) revealed that the ratio of ischemic to normal limb LDBF was significantly greater in EPC-transplanted animals compared with controls receiving saline. In conclusion, the novel cell filtration device, StemQuickE, is a useful tool to isolate MNCs from human cord blood. Moreover, MNCs obtained by this filter system can give rise to functional EPCs.
今天无意进了内皮祖细胞讨论区，看了各位战友的发言，我如获至宝。我也准备做内皮祖细胞方面的实验，查阅了些文献，对内皮祖细胞有了一定的认识，但存在许多困惑，望热心的战友帮忙。
我准备做的是经人源性骨髓内皮祖细胞的分离培养、鉴定，将内皮祖细胞进行荧光标记后，注入肿瘤动物模型体内，观察内皮祖细胞对血管形成的影响过程。我的困惑是有以下几点：
1.内皮祖细胞的培养液中如果添加了一些生长因子如VEGF,FGF后，内皮祖细胞就向成熟的内皮细胞分化，那么最终得到的是内皮细胞了，经免疫荧光及细胞流式检测的是内皮细胞的特征了，不知我这个认识是否正确。如果在我这个设计中是要的是EPC，则培养液中就不须添加生长因子了。如果不添加生长因子，内皮祖细胞容易克隆到足够的数量？
2.不知哪位战友有否了解细胞的标记技术，在文献中我有见过“Intravital Fluorescence Videomicroscopy"技术，不知具体怎么翻译，在重庆这里不知可以做不。还有,能请harry158战友将你上传的那篇文章也发给我一份么，我也没法打开链接，万分谢谢！！我的邮箱是cfl761219@163.com
如果想鉴别你的细胞是否是EPC还有一个很好的方法,就是培养后观察其集落形成的情况. MSC的集落与EPC的集落有很大的差别,很好分辨. 等我找到文献可以和大家分享.
harry158:
你好，我也打不开下面这篇综述，能否发一份到邮箱(zplyx@sina.com.cn)
综述 <Unresolved questions, changing definitions, and novel paradigms for defining endothelial progenitor cells >
(blood ,106,1525-1531).
750714 wrote:
今天无意进了内皮祖细胞讨论区，看了各位战友的发言，我如获至宝。我也准备做内皮祖细胞方面的实验，查阅了些文献，对内皮祖细胞有了一定的认识，但存在许多困惑，望热心的战友帮忙。
我准备做的是经人源性骨髓内皮祖细胞的分离培养、鉴定，将内皮祖细胞进行荧光标记后，注入肿瘤动物模型体内，观察内皮祖细胞对血管形成的影响过程。我的困惑是有以下几点：
1.内皮祖细胞的培养液中如果添加了一些生长因子如VEGF,FGF后，内皮祖细胞就向成熟的内皮细胞分化，那么最终得到的是内皮细胞了，经免疫荧光及细胞流式检测的是内皮细胞的特征了，不知我这个认识是否正确。如果在我这个设计中是要的是EPC，则培养液中就不须添加生长因子了。如果不添加生长因子，内皮祖细胞容易克隆到足够的数量？
2.不知哪位战友有否了解细胞的标记技术，在文献中我有见过“Intravital Fluorescence Videomicroscopy"技术，不知具体怎么翻译，在重庆这里不知可以做不。还有,能请harry158战友将你上传的那篇文章也发给我一份么，我也没法打开链接，万分谢谢！！我的邮箱是cfl761219@163.com
关于第一点我想谈下自己看法：
目前认为内皮祖细胞是一类能共同表达干细胞的表面标志和成熟内皮细胞表面标记，同时在体外基质胶上能形成血管的细胞。这些细胞表面标志的表达是有时间的，骨髓中的内皮祖细胞多以干细胞表面标记CD34、CD133和KDR为主，动员进入外周血以后则CD133表达逐渐减少，同时成熟内皮细胞表面标记CD31、vWF等逐渐增多；所以我们体外培养也是有这种现象，你在第3、7、14天用免疫荧光和流式测的，得到的细胞表面标记的表达率是很不同，这在文献中都可见报道的，因此我认为你的这句话“经免疫荧光及细胞流式检测的是内皮细胞的特征了”有待商榷。
至于你认为不加生长因子养出EPC，我认为机会很小，生长因子除了对EPC起一个诱导分化的作用外，还可以促进EPC的增殖，所以按你的意思是想EPC停在某个阶段在那里光克隆，不过结果可能EPC就长得很慢了，克隆集落都可能见不到了。因为还是要模拟体内细胞的内环境在那里养EPC的。
欢迎大家讨论，～
我从外周血中密度梯度离心法分离单个核细胞，然后诱导分化成EPC。在分离单个核细胞时，密度梯度离心后有时会发现FICOLL液里有白色的絮状物，请问是什么？谢谢
谢谢wzmc225的解答，让我明白了一些。那么，在体外培养的EPC是内皮细胞系的混合物，不是纯的epc了，如果我做epc体内实验，是否对其进行纯化，感谢各位战友讨论！
如果做体内epc实验，我的意见是不用做纯化，而事实上也没有办法纯化。尤其是如果是做血管重建的动物实验，各种分化程度的内皮细胞的混合反而对实验的成功很有帮助。
最近自己设计了一种培养基养脐血中的EPC，效果很nice，MCDB131为基础培养基，ECGS为因子，比起加VEGF，bFGF，EGF等因子的培养基要便宜多了，一份脐血（2×107细胞）得到14个克隆，增殖十分旺盛。上一次培养的EPC在加因子的培养基中养到第5代，然后维持不增殖状态达一个月之久，改用这种培养基后又开始焕发新的活力了，重新开始增殖，状态很好。
tydgkong wrote:
我从外周血中密度梯度离心法分离单个核细胞，然后诱导分化成EPC。在分离单个核细胞时，密度梯度离心后有时会发现FICOLL液里有白色的絮状物，请问是什么？谢谢
你的离心参数是多少??
可能是离心力太大，白膜层部分被离到FICOLL里了。
还有一种可能性是你的细胞死掉了,白色的东西可能是死细胞碎片,要把实验过程说得再详细一些才能分析.比如说怎么取的外周血,多长时间后进行的离心.离心力是多少,用的什么分离液, 细胞在洗涤之前还是在洗涤之后出现的沉淀,等等.细节决定成败.
harry158:
你好，我也打不开下面这篇综述，能否发一份到邮箱(pengsimson@tom.com)
综述 <Unresolved questions, changing definitions, and novel paradigms for defining endothelial progenitor cells >
(blood ,106,1525-1531).
这片文献上有很漂亮的EPC集落 "Granulocyte Colony-Stimulating Factor Mobilizes Functional Endothelial Progenitor Cells in Patients With Coronary Artery Disease"(Arterioscler Thromb Vasc Biol. 2005;25:296-301.)
是pdf 文件,不知道怎么上传,如果有需要请告诉我邮箱.
almasun 兄,你好,能否告知邮箱,想跟你聊聊,我的邮箱是tibetcom@gmail.com
MSN是:tibetcom@hotmail.com 谢谢.
meini wrote:
这片文献上有很漂亮的EPC集落 "Granulocyte Colony-Stimulating Factor Mobilizes Functional Endothelial Progenitor Cells in Patients With Coronary Artery Disease"(Arterioscler Thromb Vasc Biol. 2005;25:296-301.)
是pdf 文件,不知道怎么上传,如果有需要请告诉我邮箱.
这篇文章我已下到，谢谢推荐。
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下面这幅图截自这篇文章
（缩略图，点击图片链接看原图）
我刚开始做实验。来到这里非常兴奋！
有些问题想请教各位老师：
据我现在看的文献，内皮祖细胞（EPC）来源于造血干细胞。但是在细胞培养过程中，造血干细胞属于非贴壁细胞。
而我又看到在获取EPC的方法上，用到贴壁法，例如取原代培养4d后的贴壁细胞继续培养，认为以此获得EPC。那么这样，EPC就是贴壁细胞了。
所以，我感到很迷惑，到底怎样获得的就是EPC呢?
我还想请教破伤风老师：
骨髓干细胞在体外培养多久后会分化为EPC呢？
因为我想只有当干细胞分化为EPC时，检测EPC的特异抗体才有意义。那么这个时间怎么去掌握呢？
骨髓干细胞开始向EPC分化后，大概几天会分化为成熟的内皮细胞呢？
因为CD133在成熟的内皮细胞上不表达。所以，骨髓干细胞未分化为EPC之前和EPC已经分化为成熟的内皮细胞之后，CD133都是阴性的。那么怎么去把握检测时间呢？
meini wrote:
这片文献上有很漂亮的EPC集落 "Granulocyte Colony-Stimulating Factor Mobilizes Functional Endothelial Progenitor Cells in Patients With Coronary Artery Disease"(Arterioscler Thromb Vasc Biol. 2005;25:296-301.)
是pdf 文件,不知道怎么上传,如果有需要请告诉我邮箱.
谢谢！请发一份给我吧：lq4002@126.com
xsf9702071 wrote:
我还想请教破伤风老师：
骨髓干细胞在体外培养多久后会分化为EPC呢？
因为我想只有当干细胞分化为EPC时，检测EPC的特异抗体才有意义。那么这个时间怎么去掌握呢？
骨髓干细胞开始向EPC分化后，大概几天会分化为成熟的内皮细胞呢？
因为CD133在成熟的内皮细胞上不表达。所以，骨髓干细胞未分化为EPC之前和EPC已经分化为成熟的内皮细胞之后，CD133都是阴性的。那么怎么去把握检测时间呢？
首先想纠正下：
内皮祖细胞与造血干细胞共同来自共同的中胚层前体细胞血液血管母细胞(Hemangioblast)，在分化发育过程中，造血干细胞发育成血管里的血细胞，内皮祖细胞发育成内皮细胞，形成血管壁。而且内皮祖细胞是贴壁细胞，如你所说是经贴壁法诱导培养的。
“所以，我感到很迷惑，到底怎样获得的就是EPC呢? ”
我也很困惑，这个讨论区开始我就是这么说的。
内皮祖细胞是存在于骨髓的一类干细胞，不需要分化多少天，只要能分离出来就可以了。
培养骨髓来源的内皮祖细胞，同样要经单个核细胞的分离后，进行诱导培养才能获得内皮祖细胞。在这个培养过程中，你可以在第3、7、14天进行表面标记检测，看看CD133、KDR、CD34等其他标记的表达率都有多少。
你可以参考文献做～
欢迎各位讨论～
破伤风师兄：
我也是WZMC的，正准备培养EPC。有几个问题想请教你：1、分离出的单核细胞到底用M199洗涤好还是用PBS洗涤好？（浙医和上海中山医院都是用M199洗涤）如果可以用PBS洗涤将节省很多；2、M199的成分有哪些？是不是需要再加VEGF培养？（我看浙医一篇文章中好像M199包含胎牛血清、青霉素、链霉素、VEGF); 3、M199和EGM从效果和价格两方面比较那个更好？谢谢！
纠正一下，上海中山医院用PBS洗涤分离出的单核细胞！
小小鸟 wrote:
破伤风师兄：
我也是WZMC的，正准备培养EPC。有几个问题想请教你：1、分离出的单核细胞到底用M199洗涤好还是用PBS洗涤好？（浙医和上海中山医院都是用M199洗涤）如果可以用PBS洗涤将节省很多；2、M199的成分有哪些？是不是需要再加VEGF培养？（我看浙医一篇文章中好像M199包含胎牛血清、青霉素、链霉素、VEGF); 3、M199和EGM从效果和价格两方面比较那个更好？谢谢！
哪届的？PM联系
1.2个都可以洗的，细胞都能养出来的，另外如你所说用PBS洗涤将节省很多
2.M199是合成培养基，含有氨基酸、维生素、糖类、无机离子等。是专门适合于内皮系细胞生长的一种培养基。VEGF是要加的，胎牛血清、青霉素、链霉素、VEGF，都是养细胞时候加进去的，所谓条件培养液。
3.因为要加VEGF之类的生长因子，所以M199＋VEGF和EGM价格差不多。国外都用EGM的。
多谢破伤风师兄的指点！以后实验中碰到的困难还望师兄多多赐教啊！
我是04的。QQ17339961
对了，破伤风师兄，请问接种密度到底多少比较合适？我看浙医可以把
10ml 的外周血分离的单核细胞浓度调节到1*10的9次方/L，似乎有点不可思意。不过国外也有浓度为2*10的6次方/L接种成功的，究竟多少才是最佳浓度呢？
最近养了一次狗的骨髓基质干细胞,只是用了DMEM普通培养基+胎牛血清,培养3天后出现典型的EPC集落外观,没有经过任何诱导分化,经2次传代培养后免疫组化显示大部分细胞CD34+,CD31+,八因子阳性,显示了内皮分化的趋向. 尽管没有做AC133,但我推测使用一般的培养基同样可以培养EPC. 同时对以往EPC的培养方法产生怀疑:各个文献之间培养方法各异,采用的细胞因子也有不同,使用的血清之间细胞因子含量,种类又无人说得明白,因此EPC的培养完全处于自说自话的地位.希望大家开拓思路,不要迷信文献的报道.
另外,我一直在培养人骨髓来源的单个核细胞,希望从中分离出EPC,但目前为止,此类细胞在普通DMEM培养基+20%Gibco血清中良好生长,完成传代. 使用德国进口的干细胞培养基,(+血清)细胞贴壁生长良好,但没有典型的EPC集落出现.希望哪位高手给予指点.
wzmc225 wrote:
我也做了2个月了，EPC是可以养出来的，但是数量不够多啊，40ml脐血只能提取到1.7×107，我的是用羟乙基淀粉沉淀红细胞的，总感觉不太好，有时候沉淀多一点，有时候沉淀少点，毫无规律啊。望有经验战友多指点啊。
我用的是进口FICOLL和M199
外周血单个核细胞分离诱导培养epc国内陈君柱教授做的很不错，采集外周血10ml，HANKS等倍稀释，然后按和国产FICOLL1：2，置于其上层，水平离心
2000r/min，25min后，提取白膜层，5倍体积M199稀释洗2次（钱不多的话建议用HANKS或PBS都可以的），依次以2000 r/min,1500r/min，8min，然后再用
M199（含20％FBS和双抗，VEGF10 mg/l,)制成细胞悬液，浓度可调到1×109（好羡慕啊），然后接种到FN包被的24孔板上，放入37度5％CO2培养箱，4d后用PBS洗掉非贴壁细胞，再换加M199条件培养液继续培养到第7d就可以做鉴定、贴壁和迁移能力测定了。
需要摸索的参数个人认为是离心参数，各实验室差别较大。
还有一个是接种的密度，欢迎大家一起探讨。
dryudecai 战友做了人骨髓和外周血来源的，真是不错。想问下你人骨髓来源的怎么做的，如何搜集EPC 的，国内这方面报道不多，大家都很想学习学习。
谢谢，欢迎大家讨论
BY
破伤风
[color=black][/color]
我有一个问题请教一下：我在用ficoll分离液后提取到了单个核细胞层，但是用PBS液洗后不知该取哪一部分培养。
huyueming wrote:
外周血单个核细胞分离诱导培养epc国内陈君柱教授做的很不错，采集外周血10ml，HANKS等倍稀释，然后按和国产FICOLL1：2，置于其上层，水平离心
2000r/min，25min后，提取白膜层，5倍体积M199稀释洗2次（钱不多的话建议用HANKS或PBS都可以的），依次以2000 r/min,1500r/min，8min，然后再用
M199（含20％FBS和双抗，VEGF10 mg/l,)制成细胞悬液，浓度可调到1×109（好羡慕啊），然后接种到FN包被的24孔板上，放入37度5％CO2培养箱，4d后用PBS洗掉非贴壁细胞，再换加M199条件培养液继续培养到第7d就可以做鉴定、贴壁和迁移能力测定了。
以讹传讹吧，EPC为10的9次方是什么概念，大家好好想想，人血中中全部白细胞的数量级才是10的6次方呀，试问EPC能达到那样的数量级吗？
强烈呼吁学术诚信，强烈反对学术欺诈小小鸟 wrote:
对了，破伤风师兄，请问接种密度到底多少比较合适？我看浙医可以把
10ml 的外周血分离的单核细胞浓度调节到1*10的9次方/L，似乎有点不可思意。不过国外也有浓度为2*10的6次方/L接种成功的，究竟多少才是最佳浓度呢？
你好，外周血分离的单核细胞浓度调节到1*10的9次方/L是很正常的，国外也有很多这样的报道，我是山东的也一直在这么做。至于2*10的6次方/L接种成功的我没做过，无权发言，但凭我的经验感觉做的难度很大。
谢谢破伤风师兄的指点！！
八戒兄：
你在实验中也能将外周血单核细胞浓度调整到1*10的9次方/L？真是羡慕啊。不过听我师姐说外周血单核细胞不多，要将10 ml的血分离出这么多单核细胞我还是有点诧异。请问八戒兄也是用10ml血分离的吗？
同志们，这段时间养小鼠骨髓来源的EPC出现奇怪现象，其中一些细胞4天后快速增殖，迅速形成片状集落，细胞可以排列形成线样结构，且可以融合，有些还有分支，形成的结构很像带有分支的血管，奇怪了，我从来没有见过这种细胞，请各位战友帮忙看看这可能是什么细胞。
一张100倍的图
（缩略图，点击图片链接看原图）
漂亮！
我想应该还是EPC，因为我从一篇文章上见过，说EPC可以形成条索样
meini wrote:
这片文献上有很漂亮的EPC集落 "Granulocyte Colony-Stimulating Factor Mobilizes Functional Endothelial Progenitor Cells in Patients With Coronary Artery Disease"(Arterioscler Thromb Vasc Biol. 2005;25:296-301.)
是pdf 文件,不知道怎么上传,如果有需要请告诉我邮箱.
我很想要一份，请发一份给我吧，多谢：sophia.jj@126.com
