挥着翅膀的猪 wrote:
楼主你好：
本人是完全的新手，正准备用荧光定量PCR（打算用sybr green染料）测脑中两种酶的表达，导师让我先设计引物，请教楼主：
（1）普通PCR的引物是否可以直接拿来作荧光定量PCR的引物？
（2）以下是我在一篇文献中查到的引物，请帮忙看一下是否可用：
酶1 Sense: catggggaagggaggtaaccag ； Antisense: tcatttatggaggtaagcatc
酶2 Sense: atggctcccgacccggtgccg ； Antisense: ctattggtgaaggtaagcgtc
（3）酶1的上下游引物间约有1200bp，酶2的上下游引物间约有1300bp,这样的距离是不是有可能影响结果啊？
不知到我表达清楚了没，请楼主不吝赐教，拜谢！
普通PCR的引物要看扩增片段大小，如>400BP以上，就不能用于作荧光定量PCR的引物。
酶1上下游引物Tm值相差12℃，而酶2上下游引物Tm值相差21℃，且引物自身有连续4个碱基以上的互补，所以这两对引物不太可用于荧光定量PCR。
楼主好
我刚刚接触荧光定量PCR，我用的是taqman探针法，绝对定量检测病毒含量，我用质粒建立的标准品，我稀释标准品从107～102可每次出来的结果前四个点是一条线且CT值的梯度在3左右。可是后两个点在另一条线。重新稀释又是如此。
希望楼主在百忙之中帮我。谢谢
tgb0yhn,你好!我是新手,刚开始做定量PCR,结果很不好!极度郁闷啊!能否告诉我你的邮箱,请你帮我看看做的结果!我的邮箱是lielieyuyu@yahoo.com.cn谢谢了!
错了,不好意思,邮箱是chongjinghui022@yahoo.com.cn
你好：我准备做血液和肺匀浆的Bcl-2,Bax的定量PCR。我是个初初学者，请问我应该怎样准备实验1.2.3.......？越详细越好！先谢了！
不好意思，我是个新手。请问下real-time PCR 与RT-PCR之间在做法上有哪些不同？我想检测疾病不同时期某蛋白表达的变化是不是前者好些？谢谢！！
现在又发现有实时荧光定量Rt-PCR的叫法， 这种说法对吗？我想他的意思其实就是用荧光定量的方法做Rt-PCR，但能不能这么叫呢？
huangshxcm wrote:
普通PCR的引物要看扩增片段大小，如>400BP以上，就不能用于作荧光定量PCR的引物。
酶1上下游引物Tm值相差12℃，而酶2上下游引物Tm值相差21℃，且引物自身有连续4个碱基以上的互补，所以这两对引物不太可用于荧光定量PCR。
我想请问扩增片段一定要小于400bp吗？我听有些同行说与扩增片段没太大关系的，，到底怎么回事？？
我想问问PCR过程中荧光值的大小受什么影响?我做的时候,发现我的曲线最高也超不过500,而同一台PCR仪,别人做曲线经常可以高到4000~5000(X轴数值),这是怎么回事啊.
我们实验室刚开始用real time做半定量PCR,仍旧是对结果的统计方法搞不清楚。我们需要比较两个品种的猪仔同样处理前后，某个基因mRNA的变化（品种间和一个处理前后都要比较），因为无法确定哪个是对照组，因此ddCt法似乎不合适，请问还有没有别的方法？
我们实验室刚开始用real time做半定量PCR,仍旧是对结果的统计方法搞不清楚。我们需要比较两个品种的猪仔同样处理前后，某个基因mRNA的变化（品种间和一个处理前后都要比较），因为无法确定哪个是对照组，因此ddCt法似乎不合适，请问还有没有别的方法？
最近我在一些生物公司的宣传单上看到了"实时荧光定量Rt-PCR",,请问楼主这种说法对吗??
请教一个问题，我做荧光定量时，预实了一次，做出来有标准曲线，昨天就开始做实验，结果标准曲线就没了，不成梯度，除了加样原因，还有可能是什么原因呢，谢谢
这个帖子怎么没人管了 ????
大虾你好：
小弟首次作定量PCR，由于我们所用内参的长度在300bp左右，而我们设计的引物所扩增出来的条带在130bp左右，我想既然是一种确定不同虫期差异表达的相对定量问题，是否可以用该内参做标准曲线？
请大家不吝赐教，不胜感激！
新手，见笑！
版主在哪里???怎么这么多人提问,没人帮忙呢???
我用探针法，这是我的曲线，请帮忙看看怎么样，
1.doc (219.5k)
请教：
我的定量PCR准备使用单标记荧光探针与双链嵌入燃料相结合的方法，供体为Syber-green 1,受体为Cy5,请问在哪个公司可以合成探针？
奇怪都没人回答了
请问知道做real time时，cDNA的浓度最好在什么范围内？
没人管吗？
