请问关于做转染的细胞有何注意事项???
在转染前一天分细胞，转染时细胞融合度以60-80%为宜，不要用含有血清的培养基进行转染。
野毒适应的细胞是否也不一定适合做病毒拯救用?
一般来说野毒能适应的细胞都可以用来转染RNA，但是也有例外例如PRRSV的拯救选择PAMs应该是最好的，Marc145的拯救效率可能不如前者。
对于一个成熟的操作系统来说 应该说拯救的成功率是很高的，因为几乎所有的条件都是你已经摸索的好，如果好要靠运气来拯救病毒，还谈何应用？除非出现意外。
首代拯救病毒不出现病变，不一定没有成功，可以盲传3代，并进行检测，如果还检测不到病毒，最好放弃！
祝贺liuguangqing 博士成功构建了 RHDV的感染性克隆!!!
首先恭喜刘博士在浙江农科院的短短时间内就作出了这样的高水平的文章，实力的体现呀！！
关于RHDV这个病毒，我了解的不多，对于拯救这样一株病毒，在基础研究方面那是肯定有研究价值，但是不知在实际应用价值中的作用如何体现出来，而且目前大家感兴趣的还是危害人类和动物的烈性传染病，小弟无知，请刘博士指教，同时也期待这篇文章能够尽快出来！
希望在反向遗传方面的高手能够继续为大家推荐一些国外最新的反向遗传学的文章。谢谢了！
关于RHDV这个病毒，我了解的不多，对于拯救这样一株病毒，在基础研究方面那是肯定有研究价值，但是不知在实际应用价值中的作用如何体现
在实际应用方面，最突出的一点就是可以将其改造，人工减毒，获得减毒疫苗候选株，当然这要在了解致病基因的基础上 才行。另外也可以构造嵌合病毒，为研制多联疫苗作准备；还可以将其开发为一种复制子载体，以转移外源基因，这方面 的研究国内外已经有不少报道了，应该都是有可能的
感谢刘博士的热心指导!!!!!关于拯救RHDV的思路能否给简单的透漏一下啊!呵呵
喜讯: 哈尔滨兽医研究所免疫抑制病课题组2006年4月14日成功拯救出IBDV!!!
恭喜恭喜,
可喜可贺啊!!!
有那位有心人能总结一下：最近全国从事各种病毒的反向遗传学操作的研究进展（可以不写从事的科研工作者姓名）一览表？谢谢！
非常感谢独角龙和花生米两位的回复，有很长时间没有上来了，刚看到，万分的感谢，以后还希望两位写出更好的帖子，以飨各位战友。
响应VETJ的号召，就我所了解的，说一点，不对之处，请战友指出：
1 哈尔滨兽医研究所，动物流感，新城疫，水泡性口炎，法氏囊，马传贫，猪繁殖与呼吸道综合征等，其中前三个病毒做的比较成熟，正在做下游工作。
2 扬州大学，流感病毒，微生物学报等杂志上已经见到好几篇文章，但深入的研究没有看到相关报道
3兰州兽医研究所，口蹄疫，几年前也首次报道了感染性克隆的建立
4上海兽医研究所 ，PRRSV等RNA病毒，有袁老师大牛在那儿，肯定做的不错，但可能刚建立实验室不久，文章出的可能慢点。
5 浙江农科院，RHDV等病毒，同样刘博士这段时间的一篇JVI足以说明问题
6中科院上海巴斯德研究所，动物流感，准备用乙脑做载体，构建感染性克隆，可能还没有人力做出来。
7中科院广州生物与医药研究院，动物流感，准备做，没有人力资源
8中科院微生物所， 动物流感，很早就有载体了，就是没有看到东东出来
9华南农大，也是有载体，但没有作出东西。
其他如武汉病毒所，各大高校可能也在做，但不是非常清楚。
所有的都代表一家之言，没有任何偏见或其他企图，排名也不分先后，呵呵！！
可谓东西南北中全了，就是少了西南部地区的研究单位。
不知四川农大在BAC系统上有何进展没有？！
ＲＮＡ病毒“拯救”技术
近年来,在分子病毒学研究领域兴起一门新型技术,即病毒的全长感染性ｃＤＮＡ克隆技术,是一种反向遗传操作技术,通常被称为“病毒拯救”,它解决了ＲＮＡ病毒基因组难以操作这一困扰研究者多年的难题。从ｃＤＮＡ克隆拯救出负链ＲＮＡ全病毒是90年代分子病毒学研究领域最振奋人心的突破之一,它开启了对病毒基因组进行人工操作和详细了解病毒基因及其产物功能的大门。该技术发展迅速,倍受国内外研究者关注。与经典的从表型改变到进行基因特征研究的思路相反,病毒拯救技术是指通过构建ＲＮＡ病毒的感染性分子克隆,在病毒ｃＤＮＡ分子水平上对其进行体外人工操作,如进行基因点突变、缺失、插入、颠换、转位和互补等改造,以此来研究ＲＮＡ病毒的基因复制与表达调控机理、ＲＮＡ编辑和自发重组与诱导重组、病毒与宿主间的相互作用关系、抗病毒策略、基因治疗研究以及构建新型病毒载体来表达外源基因和进行疫苗的研制等。
1 病毒拯救技术的建立
建立病毒拯救技术体系主要包括基因组全长片段的ｃＤＮＡ克隆及改造、辅助质粒的构建、序列测定、共转染拯救病毒粒子和新生病毒有关特性的鉴定与应用等内容。其建立过程就是要通过在体外进行人工基因操作,使所建立的系统满足病毒复制和包装所需要的各种必要条件。基因组全长片段的克隆是病毒拯救技术的关键环节,大多数研究者均采取“分段克隆”的策略,将病毒基因组各片段顺次克隆到复制严谨性较高的低拷贝载体上。在构建ｃＤＮＡ克隆时,一般均在一处或几处合适的位置上进行沉默突变,这样便于鉴定拯救的病毒。基因组3′末端和5′末端的克隆,大多采用ｃＤＮＡ末端快速扩增法(ＲＡＣＥ),其克隆的准确性会直接影响拯救效率。为产生准确的3′端,一个重要突破是发展了带有自我剪切功能的核酶序列的载体,这样转录出的ＲＮＡ具有准确的3′端。3′端几个到几百个碱基的非病毒序列常使病毒转录本的生物活性降低甚至丧失,但一些病毒在3′端有大于30个核苷酸的额外序列而其转录本仍有感染性。很多研究者均发现,5′端转录本序列的正确与否对病毒复制的影响比3′端更重要。5′端冗余的核苷酸常使拯救出的病毒的感染性降低甚至消失,这在植物病毒上尤为明显。有趣的是,在大多数动物病毒上这种影响相对较小。而且,很多研究均发现,5′端少量多余的核苷酸(一般为1～3个Ｇ碱基)为Ｔ7ＲＮＡ聚合酶适宜的起始序列,会促进转录,提高拯救效率。在宿主细胞核酸酶的参与下,额外的碱基会在复制中消失。因此,5′端和3′端非病毒序列对拯救的影响尚难以定论。虽然通常认为获得感染性克隆需全长病毒序列,但病毒不完全ｃＤＮＡ克隆也会产生感染性转录本。很多负链ＲＮＡ病毒基因组核苷酸总数均为6的倍数,这首先是由Ｅｇｅｌｍａｎ等在对仙台病毒的研究中发现的。随后其他研究者也在仙台病毒、麻疹病毒及新城疫病毒中均发现这一规律,并称之为“6碱基原则”。只有遵循这一原则,病毒才能有效地转录、复制和包装,因此,在构建ｃＤＮＡ克隆时应考虑到这一点。不过,研究发现,并非所有病毒均遵循这一原则。在进行病毒拯救之前,研究者大多先尝试构建病毒微型基因组。在启动子下游插入报告基因或较短的病毒基因组片段,2端为病毒ＲＮＡ复制所必需的病毒前导序列和尾随序列等调控序列,即构成ｃＤＮＡ来源的微型基因组,与表达辅助蛋白(如新城疫病毒的ＮＰ、Ｐ和Ｌ蛋白)的辅助重组质粒共转染,微型基因组在细胞内复制和转录,通过鉴定报告基因的表达即可用来初步衡量所建立的拯救系统。Ｐａｔｔａｎｉｋ等通过构建ＶＳＶ所有病毒蛋白的表达质粒,第一个建立了依赖质粒的微型复制子系统。Ｐｅｅｔｅｒｓ等用碱性磷酸酶基因(ＳＥＡＰ)构建了新城疫病毒的微型基因组,利用该系统证实了新城疫病毒的复制需遵循以上提到的“6碱基原则”。各种微型基因组的构建表明,ＮＰ、Ｐ和Ｌ蛋白对杆状病毒和副粘病毒基因组的复制是必需的;流感病毒复制所必需的蛋白是核蛋白、ＰＢ1、ＰＢ2和ＰＡ蛋白。现在,很多病毒的微型基因组均已构建成功并在拯救系统中得以应用。
2 从ｃＤＮＡ克隆拯救感染性病毒
通过病毒拯救技术,首先成功拯救出有感染性的病毒是单分子不分节段负链ＲＮＡ病毒目中的狂犬病病毒。1994年,Ｓｃｈｎｅｌｌ等将狂犬病病毒ＮＰ、Ｐ和Ｌ基因的重组表达质粒与含病毒全长反义基因组的质粒共转染预先感染有能表达Ｔ7ＲＮＡ聚合酶的重组痘苗病毒(ｖＴＦ 3)的细胞。在细胞内,转染的质粒通过形成ＲＮＰｓ,然后在聚合酶的作用下进行复制、转录和翻译,即组装和释放出完整的病毒粒子,这样就成功地获得了重组狂犬病病毒。不过,其拯救效率较低,在107个转染细胞中大约只获得1个病毒粒子。随后,其它一些不分节段的负链ＲＮＡ病毒也相继用感染性ｃＤＮＡ克隆技术获得成功,包括水泡性口炎病毒、麻疹病毒、仙台病毒、呼吸道合胞体病毒、人副粘病毒3型、传染性猴病毒5型、新城疫病毒和犬瘟热病毒等。现在,很多序列标记病毒和带有不同糖蛋白产生不同血清型的病毒均已拯救成功。值得注意的是,在拯救之前共转染的质粒上有可能会发生同源重组,这方面已有研究报道,特别是利用痘苗病毒所建立的拯救系统。该系统除可能会引起ＲＮＡ重组外,痘苗病毒产生的细胞病变会影响刚刚拯救出的生长还较缓慢的新病毒的增殖,另外,新拯救出的病毒还需经复杂的步骤从痘苗病毒中进行分离。因此,用痘苗病毒所建立的拯救系统尚存在一定弊端。通过优化辅助质粒的比例和降低痘苗病毒所带来的不利影响等方法可一定程度上提高拯救效率。Ｔａｋａｈｉｒｏ等对仙台病毒(ＳｅＶ)的拯救系统进行了优化,将痘苗病毒ｖＴＦ7 3用补骨脂素处理并用360ｎｍ的紫外线照射后再感染转染用的细胞,处理后的ｖＴＦ7 3复制受到抑制,对细胞的损害降低,但仍保持表达Ｔ7ＲＮＡ聚合酶的功能。将ＳｅＶ的Ｆ基因用ＧＦＰ基因替换并在基因组上游非必需区内插入ＬａｃＺ基因,用以上系统进行反向遗传操作,发现两个报告基因均能很好地表达。因重组痘苗病毒ｖＴＦ7 3能在哺乳动物细胞上有效复制,产生细胞病变,进而影响拯救效率。因此,从1997年开始研究使用宿主范围突变的ＡｎＫａＲａ株痘苗病毒ＭＶＡ Ｔ7。ＭＶＡ Ｔ7可在禽类细胞中生长,但在哺乳动物细胞中不产生子代病毒,完成其辅助功能后即自我限制复制,因此大大减少了辅助病毒所产生的细胞病变。应用该株病毒已成功拯救出了犬瘟热病毒(ＣＤＶ)和人副粘病毒3型(ＨＰＩＶ 3)等许多ＲＮＡ病毒。2000年,Ｋｒｉｓｈｎａｍｕｒｔｈｙ等也用ＭＶＡ Ｔ7系统拯救出了中发型新城疫病毒ＢｅａｕｄｅｔｔｅＣ株,并将ＣＡＴ基因插入到ＨＮ与Ｌ基因之间的非必需区获得了表达。由此可见,用重组痘苗病毒感染细胞所建立的病毒拯救体系存在一定的缺陷,操作较繁琐,成功率也较低。稳定表达Ｔ7ＲＮＡ聚合酶的细胞系的建立,为这一问题的解决提供了新的思路。1995年,Ｒａｄｅｃｋｅ等用293细胞建立了一个稳定表达Ｔ7ＲＮＡ聚合酶、麻疹病毒Ｎ蛋白和Ｐ蛋白的细胞系293 3 46。主要方法是将ＣＭＶ启动子控制下的Ｔ7ＲＮＡ聚合酶基因、麻疹病毒Ｎ蛋白和Ｐ蛋白基因的3种质粒线形化后共转染293细胞,用新霉素进行逐步抗性筛选,存活细胞中Ｎ蛋白和Ｐ蛋白基因的表达用Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔｔｉｎｇ方法鉴定;根据Ｔ7启动子 Ｔ7ＲＮＡ聚合酶特异性识别的特点,通过检测报告基因(虫荧光素酶基因)的表达来评价Ｔ7ＲＮＡ聚合酶基因的表达及功能发挥。应用这一系统,在构建带有ＣＡＴ基因的正义和反义微型基因组中均能检测到报告基因的表达。同时,将ＭＶ的Ｆ基因5′端非编码区504个核苷酸缺失后也能成功地进行拯救。此后,一些研究者对该拯救系统进行了改进,如将转染后的细胞放在水浴中进行热休克,发现用该方法处理会使一些病毒如麻疹病毒的产量有所提高。1999年,Ｂｕｃｈｈｏｌｚ等用ＢＨＫ 21细胞建立了稳定表达Ｔ7ＲＮＡ聚合酶的细胞系(ＢＳＲＴ7 5)并成功拯救出了牛呼吸道合胞体病毒。同年,Ａｎｇｅｌａ等也用该细胞系拯救出新城疫病毒疫苗株Ｃｌｏｎｅ 30,拯救出的病毒与野生型病毒在生物学特性上均相同。Ｋｅｎ ｉｃｈｉＩｎｏｕｅ等最近报道,利用该细胞系和在Ｔ7启动子控制下的狂犬病病毒基因组全长ｃＤＮＡ克隆拯救出了狂犬病病毒,但与以往不同并引人注意的是,同时将基因组全长ｃＤＮＡ克隆在ＣＭＶ启动子下游,利用转染细胞的ＲＮＡ聚合酶ＩＩ,在Ａ Ｊ鼠源的ＮＡ细胞,293Ｔ细胞、ＢＨＫ 21细胞上均能成功地拯救出狂犬病病毒,而且所建立的新型拯救系统比经典的Ｔ7ＲＮＡ聚合酶系统拯救效率还要高。这表明,在建立不分节段负链ＲＮＡ病毒拯救系统时,除利用Ｔ7ＲＮＡ聚合酶 Ｔ7启动子系统外,还可以摸索建立其他更有效的新型病毒拯救系统。
3 病毒拯救技术的应用
现常应用病毒拯救技术来鉴定病毒某些蛋白的功能及进行致病性研究,如在负链ＲＮＡ病毒上的一个应用是通过去除某些病毒Ｐ基因编码的可选择的基因产物Ｃ蛋白和Ｖ蛋白,以此来评价它们在病毒复制和致病中的作用,而这一问题用经典的分子生物学技术难以解决。现已拯救了很多缺失这两种蛋白的病毒,如ＶＳＶ、ＳｅＶ、ＭＶ等。副粘病毒的Ｍ蛋白在病毒核衣壳和ＲＮＰｓ之间形成一个单层,对病毒组装至关重要,通过反向遗传技术将突变的Ｍ蛋白整合进仙台病毒,结果表明,重组病毒仍保留该突变,Ｍ蛋白的磷酸化并非为病毒生长所必需。利用病毒拯救技术对ＲＮＡ病毒的ｃＤＮＡ克隆进行点突变,已证实如登革热、脊髓灰质炎、委内瑞拉马脑炎和乙型脑炎等病毒一系列的毒力相关位点,通过基因突变、缺失、重排等方法,都有可能获得理想的减毒株来研制疫苗。与传统的细胞传代获得减毒株的方法相比,具有减毒途径明确、效率高、毒力回复率低等优点,是疫苗研制的新方向。Ｔｅｓｈｏｍｅ等通过对新城疫病毒ｃＤＮＡ克隆进行3种基因操作,获得了Ｖ蛋白低水平表达的重组病毒,对不同日龄的鸡胚进行接种及攻毒保护试验,结果表明,重组病毒对鸡胚的致病性降低,孵化率不受影响,攻毒后能获得很好的保护效果。对于ＮＤ的防制目前尚无理想的疫苗用来进行胚内接种,主要是因疫苗会引起鸡胚高的死亡率和低的孵化率,因此,通过病毒拯救技术,进一步降低Ｖ蛋白的表达而不丧失病毒的免疫原性,是研制新型ＮＤ疫苗的一个很有希望的策略。病毒拯救技术在表达外源基因,寻找新型疫苗载体方面显示了非常好的前景。负链ＲＮＡ病毒不具有ＤＮＡ相,因此不会把其基因组信息整合进宿主细胞,在安全性上具有很大优势。目前,很多外源基因均已在不同的拯救病毒上得到表达,如报告基因ＣＡＴ在传染性呼吸道合胞体病毒、新城疫病毒、水泡性口炎病毒和猪瘟病毒等病毒上已得到表达;虫荧光素酶基因在仙台病毒、犬瘟热病毒上;ＬａｃＺ基因在狂犬病病毒上;ＧＦＰ基因在仙台病毒、猴病毒5型、麻疹病毒、新城疫病毒和猪瘟病毒等病毒上都已得到很好的表达。不过目前所表达的外源基因主要集中于片段较小的报告基因。通过病毒拯救技术,将合适的抗体和膜融合蛋白整合到病毒蛋白上,可利用拯救出的病毒来杀死癌细胞进行基因治疗。1999年,Ｍａｈｅｎｄｅｒ等将白细胞介素12(ＩＬ 12)的两个亚基Ｐ35和Ｐ40基因插入到麻疹病毒基因组ｃＤＮＡ克隆的Ｈ和Ｌ基因序列之间,拯救出的ＭＶ在细胞培养上传10代仍稳定表达ＩＬ 12,而ＭＶ的复制不受影响。证实ＭＶ可用来表达外源基因进行免疫预防和基因治疗。Ｔａｋａａｋｉ等将流感病毒ＨＡ基因插入到ＨｉｔｃｈｎｅｒＢ1株ＮＤＶ基因组ｃＤＮＡ克隆的Ｐ与Ｍ基因之间,拯救出的ＮＤＶ对鸡胚毒力降低,接种鼠后无不良反应,接种后第35天用Ａ ＷＳＮ 33株流感病毒攻击能很好保护,表明重组的ＮＤＶ可作为疫苗载体。此外,流感病毒的ＨＡ基因在拯救的重组ＶＳＶ和犬瘟热病毒中均得到表达,可诱发有效的免疫反应。利用病毒拯救技术来构建嵌合病毒也是当前反向遗传学研究的热点。2001年,Ｐｅｅｔｅｒｓ等[18]利用ＮＤＶＬａＳｏｔａ株和禽副粘病毒4型的ＨＮ基因构建了含嵌合ＨＮ基因的ＮＤＶ。重组的ＮＤＶ失去血凝活性,但免疫4周龄ＳＰＦ鸡后用致死剂量ＮＤＶ攻击可完全保护。因此,所建立的这一方法可将ＮＤＶ重组疫苗免疫动物与自然感染动物区分开来。最近,该研究小组又将ＳＥＡＰ基因插入到新城疫病毒ｃＤＮＡ克隆的4个不同位置,证实外源基因插入到不同位置均不会严重影响病毒的复制效率和产量。Ｍａｔｔｈｉａｓ等构建成功人类细胞ＣＤ4蛋白与ＶＳＶＧ蛋白跨膜区和胞浆尾相连的嵌合蛋白,该嵌合蛋白可高效地整合进芽生的ＶＳＶ粒子表面,提示这一方法可用来进行病毒的基因打靶、膜蛋白纯化和诱导特异性的免疫反应等方面的研究。Ｈｏｎｇ等成功获得同时表达人呼吸道合胞体病毒Ａ亚群和Ｂ亚群Ｇ糖蛋白的嵌合病毒,表明可用拯救技术来研制预防人呼吸道合胞体病两个亚群的双价疫苗。
4 展 望
综上所述,病毒拯救技术在病毒基因功能定位、外源基因的表达、基因治疗和疫苗研制等许多方面都是强有力的工具和手段,将发挥越来越大的作用。科学是一把双刃剑,作为一种新发展起来的分子生物学技术,不可避免存在一些潜在的问题。如在猪瘟病毒的反向遗传研究上发现,转录产物和相应的野生型比较,感染性要强得多,而且全长ｃＤＮＡ克隆相当稳定。已有报道由全长ｃＤＮＡ克隆获得的正链ＲＮＡ病毒的毒性要超过原毒株。在新城疫病毒ＬａＳｏｔａ毒株Ｆ蛋白的裂解位点引入3个碱基的突变,发现拯救出的ＮＤＶ毒力大大增加(ＩＣＰＩ=1 28)。通过病毒拯救技术现在可获得已经绝种的流感病毒株,如1918年西班牙流感病毒剧毒株。人工合成的转录本具有生物活性,在病毒复制过程中也可能会发生ＲＮＡ重组或基因突变。所有这些均提示研究者在利用该技术时要充分考虑到生物安全问题,不能盲目和随意地去构建不可预知的新病毒,以尽量减少和避免基因操作污染,使病毒拯救技术能更好地为人类服务。
to ruimufang;老兄,粘这些大豆腐太占地方,把文章检索路径登出来更好,不是吗??!!呵呵 一家之言 不要生气哦
zoeeoz wrote:
各位武林高手， 看到上面的论述真让我大开眼界， 我想请教诸位， 如果要研究病毒的细胞受体，可以在那方面下手较好， 应用反向克隆可否构件一相关序列使之与病毒本身竞争性结合，从而阻断病毒与细胞受体的结合。希望各位高手不吝赐教。
可以使用Selex技术，利用核酸配体，和病毒本身竞争结合，从而研究病毒受体功能。
N代表任意核苷酸,同样是BsmB I位点,由于识别位点和酶切位点的不一致,造成用同样的酶切出的粘端不一样.一句话,能被BsmB I识别的序列可能不完全一样,被BsmB I切开的粘端也可能不一样.类似的酶还有很多,譬如sapI.
RNA病毒的反向遗传学,是采用病毒的遗传材料,在培养细胞或易感宿主中重新拯救出活病毒或类似病毒物质。能够拯救病毒的遗传材料称为感染性克隆,一般是在细菌质粒中含有整个病毒基因组的cDNA拷贝,使得cDNA本身或从cDNA体外转录所得的RNA具有感染性。RNA病毒的反向遗传系统通过定向修饰病毒的基因组序列,检测被拯救的人工改造病毒的表型,可以在体内(in vivo)有效地研究病毒基因结构、功能和病毒-宿主相互作用。自1978年第一例RNA病毒Qβ噬菌体的成功拯救以来,各类RNA病毒的分子生物学研究取得了长足的进展,这主要归功于各种RNA病毒反向遗传系统的建立和发展。该技术的核心是首先构建RNA病毒的全长cDNA分子，并使之受控于RNA聚合酶启动子，通过体外转录过程再次得到病毒RNA，然后将该转录物RAN转染哺乳动物细胞可拯救到活病毒，由于这种拯救病毒是来自全长cDNA分子,因此可以在DNA水平上对病毒基因组进行各种修饰或改造,然后通过拯救病毒的表性变化来判断这些基因操作的效果,从而达到对病毒基因组表达调控机制,病毒致病的分子机理等进行研究的目的,甚至还可以得到减毒毒株，开发新型的疫苗。目前已有许多RNA病毒的全长感染性cDNA克隆构建成功
反向遗传学是近年来兴起的在DNA水平上研究RNA病毒的一门工具反向遗传学是近年来兴起的在DNA水平上研究RNA病毒的一门工具，近年来对这方面的报道也逐渐增多．在动物病毒上，一些RNA病毒已成功获了拯救，尽管如此，从事该领域的研究仍困难重重．毕竟影响的因素很多．对于一些基因组较小病毒，可能稍容易一些，对较长的基因组病毒，如想成功拯救，可能并不容易，在全长基因组的连接和最后全长cDNA克隆载体的选择方面，就是让人头大的问题．希望在该领域有经验的老师，能在这里多多交流您的宝贵意见．
BAC系统于MDV中的应用
Manipulating infectious Marek ’s disease virus (MDV)bacterial artificial chromosome (BAC)clones. a |Infectious MDV clones.Three of the four MDV BACs that have been generated and described so far contain mini-F sequences (pHA1)instead of MDV094 (U S 2 ),which is dispensable for virus growth in vivo and tumorigenesis.The mini-F sequences in BAC20,pCVI988 and pRB-1B are flanked by loxP sites (red circles)that are amenable to Cre-mediated recombination,which allows vector sequences to be removed from the final virus construct 29,30,32 .b ,c |The principle of Red (RecET)recombination,which exploits the DNA recombination machinery encoded by prophage Rac or phage λ.Red recombination requires double-strand breaks and short homology arms of only 30 to 50 base pairs.Linear DNA,usually a positive-selection marker amplified by PCR,is protected from degradation by the activity of Gam blocking RecBCD.The exonuclease RecE (Rec α or Exo in phage λ )generates a 3 ′ overhang by processive degradation of the 5 ′ strand.The single- stranded-DNA-binding protein RecT (Rec β or Bet in phage λ )finally introduces the linear DNA fragment into a replication fork 127,128 .d |A two-step Red recombination that utilizes counter-selection of recombinants by utilizing homing
endonucleases,such as I-SceI,allows markerless modifications such as point mutations and insertions of short or longer sequences.After a first Red recombination,which is selected for by screening for the presence of the positive selection marker,usually an antibiotic-resistance gene such as aphAI ,which confers resistance to kanamycin,a second Red (‘en passant ’)recombination then results in removal of the selection marker by utilizing a double-strand break generated by cleavage with I-SceI in close proximity to a sequence that had been duplicated 129 .IR L/S ,internal repeats long/short region;
TR L/S ,terminal repeats long/short region;U L/S ,unique long/short region.
（缩略图，点击图片链接看原图）
请问刘老师：
克隆到pBlescript SK+载体KpnI/SacII位点上的片段用KpnI/SacII酶切下来，经过T4 DNA polymerase 处理后进行体外转录，使用的是stratagene公司的RNAMaxx，以TAE进行非变性凝胶电泳，电泳图如下：
酶切下来的片段最5‘端具有T7启动子核心序列，酶切片断7.2 kb，体外转录产物应该为7200 nt。如图，左边是RNA样品，25微升体外转录反应体系取样3ul电泳。
右边是15000 bp的DNA marer。请各位帮我看一下，这样的体外转录是不是可以说失败了？
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各位老师好：
我是一个新手，目前正在做硕士论文，也是构建病毒全长，试验很不顺，向各位老师求助！
你做什么毒？什么策略？
向大家请教几个问题，还请大家赐教：
１ 我在做感染性cDNA时，曾出现酶切后的质粒比原质粒电泳跑的快，酶切肯定起作用了，这是怎么回事，片段4500
２ 用BamHI,HindIII双酶切后，载体对照转化也很多，降低载体量后有所缓解，但还是比较多，试问载体自连的原因是不是酶切不充分，按理说这种简单的定向克隆应该不会出现这种情况啊，请教
３ 载体去磷酸化后会不会影响转化效果
各位前辈：我是一名做病毒拯救新手，现在不知从何入手，能否给我一些病毒拯救资料。
to fyf846:
1.有可能是双酶切不完全,特别是切胶回收时,误沾有酶切不完全的质粒.建议你两个酶分开先后切;
2.载体去磷酸化后当然不会影响转化效果,但双酶切就不需要去磷酸化了.
谢谢．我再试试看
独角龙 的观点非常同意
我是研二的学生，我的硕士论文做拯救一个病毒，目前正用传统的克隆方法进行全长cDNA拼接，我想请教各位：为什么做转染细胞时要线性化再转染？其原理是什么？
keke071903
你在做什么病毒?
可以说说,大家才好讨论啊,
