我们可以在上面找到酶的单位定义、保存条件、酶切体系[buffer及与其它酶双切的buffer等]、酶切反应温度[有些酶是在50、55或30等温度下反应的]、酶是否受甲基化影响、是否有星号活性及出现星号活性的可能因素、保护性碱基问题等等，此外，我们还可以比较便捷地找到同尾酶、同裂酶等信息。这些可以提高我们对内切酶的认识，减少出现问题的可能。
在酶切实验中，还会出现其它一些问题，这些问题可能具有普遍性，至少在我身上出现过，因此整理了一些问题，希望对大家有用，同时感谢amberly、wht5945等战友的热情讨论和支持及斑竹的加分鼓励，同时希望战友们能够分享自己的经验，共同将trouble shooting完善，THANKS！
1. 酶切不开或酶切不完全
1.1 质粒问题：酶切不开或酶切不完全，质粒的纯度差或残留酶切抑制物的可能是最为常见的问题。质粒纯度不够，一些杂蛋白的存在会影响酶切反应，通常表现为A260/A280的比值低于1.8；质粒提取时有酶切抑制物的残留，常见的有酚、盐、乙醇等；【建议重新提取DNA，使用可靠的试剂盒，或可靠的手工提取试剂，具体可参考帖子
> [针对载体酶切位点近末端位点碱基个数对酶切影响的资料]
2. 质粒酶切时出现smear。
2.1 体系中的内切酶含量过高：通常酶切体系中的内切酶含量不宜超过酶切体系的10％，不管是单一酶切还是双酶切，酶的含量在5％一下是比较合适的。由于酶是保存在50％甘油缓冲液中，过高的酶用量会导致甘油含量提高，而从引起酶的星活性；
2.2 酶切反应过程中有导致星活性的因素：有些内切酶除了对甘油浓度外，对离子浓度、反应温度、酶含量、反应时间等都可能产生星活性。所以在使用内切酶时，一定要留意说明书中的描述，避免可能出现星活性情况的发生。减少酶用量、合适的反应温度、不进行长时间的酶切反应，可减少星活性的出现。
2.3 酶切体系可能污染了其它物质：如其它的DNA、其它的内切酶或DNA酶等。
更新【20070428】
感谢amberly战友的支持和提议, 尤其感谢wht5945战友对“内切酶热失活温度”、“星号活性”以及“酶切位点保护碱基”等内容的补充与整理。
wht5945战友的帖子除了补充和整理外，还具有独立参考的价值。
他的宝帖见：
限制性内切酶的热失活：http://www.....cn/bbs/post/view?bid=154&id=8893410&sty=3&age=0&tpg=1&ppg=1#8893410
内切酶星号活性：http://www.....cn/bbs/post/view?bid=154&id=8893487&sty=3&age=0&tpg=1&ppg=1#8893487
限制性内切酶保护碱基：http://www.....cn/bbs/post/view?bid=154&id=8893511&sty=3&age=0&tpg=1&ppg=1#8893511
总结的好啊，辛苦辛苦！
辛苦辛苦，非常好！多谢多谢
建议再加上保护碱基资料，
以及一些不在37度反应的酶，
一些65度不能失活的酶，
一些容易产生星号活性的酶
amberly wrote:
辛苦辛苦，非常好！多谢多谢
建议再加上保护碱基资料，
以及一些不在37度反应的酶，
一些65度不能失活的酶，
一些容易产生星号活性的酶
谢谢amberly的关注和支持, 我将按你的建议继续整理完善的, THANKS
非常感谢阿
放进37度之前，用vortex或移液枪混一下是否更好一些，能把壁上的液体旋掉!但注意枪头不要尽量沾带上溶液，减少体系损失！
新手添加！
限制性内切酶的热失活
热失活是终止酶切反应的一种简便易行的方法。大多数最适反应温度是37℃的酶在65℃下温育20分钟即可失活。一些在65℃下不能失活的酶如将温度升高至80℃，温育20分钟也可失活。下表注明了每种酶的失活条件。
在50μl的反应体系中，37℃条件下，以0.5μg小牛胸腺DNA作为底物，加入5-10μl内切酶及相应缓冲液，反应60分钟，然后升温至65℃或80℃温育20分钟进行热失活。在上述混合液中加入0.5μg底物DNA（通常为λDNA），调节温度至最适反应温度，温育60分钟。若琼脂糖电泳显示底物部分或完全被消化，则表明该酶没有完全被热失活。
下面附上一些酶热失活的温度表
酶的热失活温度1.doc (224.5k)
这是第二部分..
酶的热失活温度2.doc (109.0k)
内切酶星号活性
在非理想的条件下，内切酶切割与识别位点相似但不完全相同的序列，这一现象称星号活性。有人提出，这种"星号"活性可能是内切酶的一种普遍特性（1），如果提供给相应反应条件，所有内切酶都会出现非特异性切割。NEB已证实下列酶存在星号活性：Apo I（2）、Ase I（2）、BamH I（3）、BssH II（2）、EcoR I（4）、EcoR V（5）、Hind III（1）、Hinf I（6、7）、Pst I（8）、Pvu II（9）、Sal I（8）、Sca I（2）、Taq I（10）、Xmn I（2）。
酶识别特异性的改变受酶本身的性质及可能引起星号活性的反应条件影响。常见的引起酶识别改变的条件有：单碱基替换、识别序列外侧碱基缩短以及单链切刻（10）。Polisky等（4）对EcoR I的早期研究表明，在低盐浓度、高pH值条件下，EcoR I可能切割N/AATTN序列；最近，Gardner等（11）的研究表明，只要识别中心的四碱基序列（AATT）不出现A/T替换，EcoR I可以切割其它任何单碱基替代序列。
大多数星号活性是可以控制的，做酶切反应时一般不考虑这方面的因素。只要在正常条件下，使用随酶提供的NEBuffer，NEB的酶就不会出现星号活性。下面列出了导致或抑制星号活性的因素。
导致星号活性的因素：
1. 较高的甘油浓度（>5% v/v）；
2. 酶与底物DNA比例过高（不同的酶情况不同，通常为>100 U/µg）；
3. 低盐浓度（<25 mM）
4. 高pH值（>pH 8.0）
5. 存在有机溶剂（如DMSO、乙醇(9)、乙烯乙二醇、二甲基乙酰胺、二甲基甲酰胺、sulphalane(12)等）
6. 用其他二价离子替代镁离子（如Mn++，Cu++，Co++，Zn++等）
以上因素的影响程度因酶的不同而有所不同。例如EcoR I比 Pst I对甘油浓度更敏感，而后者则对高pH值更敏感一些(2)。
抑制星号活性的方法：
1. 尽量用较少的酶进行完全消化反应。这样可以避免过度消化以及过高的甘油浓度。
2. 尽量避免有机溶剂（如制备DNA时引入的乙醇）的污染。
3. 将离子浓度提高到100-150 mM（若酶活性不受离子强度影响）。
我有点不明白，上图是检测内切酶在切割不同寡核苷酸时的效率数据，怎么能作为保护碱基的设计用呢？我设计引物是随机设计保护碱基也切得很好呀？望楼主及战友们赐教
请教各位老师:
我做了一次酶切,虽然有目的条带(载体和目的基因,目的基因不是很明显,相反在其下方的条带更明显),也就是说有杂带,请问这结果的肯能原因.
我的菌株是从其他老师那里得来的,提取出来的质粒好象比理想的要大(理想4000左右,跑出来的比5000大).双酶切质粒载体很明显(pUC2700左右),就是目的基因1400位置比较模糊(还是有),900左右位置却更明显,而且下方还有杂带. 按道理不应该酶把目的基因切断. 请问可能的原因有哪些啊,怎么改进啊.谢谢了.
aiguozhe2001 wrote:
我有点不明白，上图是检测内切酶在切割不同寡核苷酸时的效率数据，怎么能作为保护碱基的设计用呢？我设计引物是随机设计保护碱基也切得很好呀？望楼主及战友们赐教
的确，上图是检测内切酶在切割不同寡核苷酸时的效率数据，数据不仅考虑到末端碱基数量的影响，同时还考虑到了末端碱基组成对酶切效率的影响，唯一存在推敲的是，这些数据是使用“寡核苷酸”进行实验的数据。
也就是说，保护性碱基的设计，除了要考虑“碱基个数”外，“碱基组成”也是要考虑的。当然，我们大多数战友，包括我自己，考虑最多的是“碱基个数”，对“碱基组成”的考虑通常是采用随机，或兼顾引物Tm及GC％上。
因此，只考虑“碱基个数”是比较省事的选择，且似乎还没有出现问题，至少我的实验还没有出现因为“碱基组成”不当而影响酶切的事情。
下表是引自TAKARA的，我个人觉得应该适合NEB、MBI、PROMEGA等其它的酶，它给出的结果仅考虑了“碱基个数”，对我们可能有帮助。
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funnity wrote:
请教各位老师:
我做了一次酶切,虽然有目的条带(载体和目的基因,目的基因不是很明显,相反在其下方的条带更明显),也就是说有杂带,请问这结果的肯能原因.
我的菌株是从其他老师那里得来的,提取出来的质粒好象比理想的要大(理想4000左右,跑出来的比5000大).双酶切质粒载体很明显(pUC2700左右),就是目的基因1400位置比较模糊(还是有),900左右位置却更明显,而且下方还有杂带. 按道理不应该酶把目的基因切断. 请问可能的原因有哪些啊,怎么改进啊.谢谢了.
1. “理想4000左右,跑出来的比5000大” —— 质粒是否经过单酶切处理？如果只是简单的将质粒进行电泳，数据是不具有参考意义的。
2. “目的基因1400位置比较模糊(还是有),900左右位置却更明显,而且下方还有杂带. 按道理不应该酶把目的基因切断.” —— 仔细分析一下酶切位点，确认除了外源片断两端外没有其它的内部切点。
最好附图，这样可以更好的讨论问题。
GOOD LUCK
看不清楚; 原也不行!
能告诉我从那来的吗?(ldjiang1@yahoo.com.cn)
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我需要去掉质粒上eGFP后的中止子,用于融合表达,方法是:在eGFP片断的上下游分别设计引物做pcr后连接,上游加BamH1的酶切位点,下游加Bgl2的酶切位点(同质粒上的酶切位点,不能改).
pcr没有问题,连接也有菌落长的很好,但是挑了40多个克隆,都是自连的,(我没有用碱性磷酸酶 磷酸化质粒).BamH1和Bgl2的粘性末端是一样的,但是pcr都没有,所以考虑是自连.
其他因素排除后,我觉得可能是引物合成出错导致pcr产物不能酶切,就又在另一个公司合成了引物,但是重新做的连接,挑了10个菌做pcr还是阴性.
我现在怀疑是不是引物设计的问题了,我在酶切位点前面加的保护性碱基会不会影响酶切的效率.请高手帮忙看一下我的引物,谢谢
上游: ATT GGATCC GGA TCT GCG ATC GCT CC
下游: ATA AGATCT ACT ACT GCT TCC GTA CAG CTC GTC CAT GC(由于融合表达,加了几个弱性aa)
to sheine:
你很着急的心情可以理解，不过发帖也重复太多了，估计斑竹要删你的帖子了，呵呵。
你的问题，我有一点小建议，回复到你的其中一个原帖中，链接如下，看看对你是否有帮助：
【求助】连接不起,请帮忙
>
谢谢jeepMax老师, 我后来重新做过了一次,效果还不错。上次做的可能就是酶切位点分析有误。
写的好，非常感谢，正寻找这方面的资料
补充：用于吸取酶液的枪头灭菌后最好先烘干，否则会带入少量水分，多次以后会使酶液浓度降低，同时使酶液冻结失活。
