小小鸟 wrote:
请教WZMC斑竹：
FN和VEGF的使用浓度各多少比较合适？
1. 我看比较多的朋友将FN稀释成50ug/ml，但也有朋友说将其稀释成25ug/ml甚至更稀，用在兔EPC也行；不知道这个浓度（25ug/ml）可否用在培养人EPC时做包被？
2.我VEGF说明书上写的VEGF的使用浓度范围为1.0～8.0ng/ml，但一个朋友却说这个浓度太小了，他用的是20ng/ml；不知道到底多少的浓度比较合适？是不是我说明书上有错？谢谢！
我养的大鼠EPC，VEGF的浓度为10ng/ml，效果不错
FN我们倒没用，贴壁也还可以：）
小小鸟 wrote:
请教WZMC斑竹：
FN和VEGF的使用浓度各多少比较合适？
1. 我看比较多的朋友将FN稀释成50ug/ml，但也有朋友说将其稀释成25ug/ml甚至更稀，用在兔EPC也行；不知道这个浓度（25ug/ml）可否用在培养人EPC时做包被？
2.我VEGF说明书上写的VEGF的使用浓度范围为1.0～8.0ng/ml，但一个朋友却说这个浓度太小了，他用的是20ng/ml；不知道到底多少的浓度比较合适？是不是我说明书上有错？谢谢！
我养的大鼠EPC，VEGF的浓度为10ng/ml，效果不错
FN我们倒没用，贴壁也还可以：）
有谁知道eNOS的目的基因序列？***人知道，但是怀有一颗赤诚爱国之心的我决定先问自己人（估计***人也不会告诉你）。破伤风大哥还有其他战友们，有的话给一个，老板催的紧！
我养EPC遇到很多问题，非常头痛。请各位高手指点指点。我用国产大鼠淋巴细胞分离液分离大鼠外周血，分离后三层界面中，分离液层浑浊，单个核细胞层呈絮状，而分离骨髓却很好，不知是哪里出了问题？不知取抗凝血后需静止后再对倍稀释吗？另外怎样克服小黑虫的污染？
大家好，我现在正在做养内皮祖细胞的准备工作。有个问题很让我头痛：现在大家用的培养皿大多数都是用纤连蛋白覆盖的，我不知道怎么才叫覆盖，是直接把试剂放到容器里吗？还是用其他的方法？纤连蛋白的浓度是多少？老板催的很急，我短时间内很难找到答案，所以大家多多帮忙！先谢谢了！
kongguyoulan222 wrote:
我养EPC遇到很多问题，非常头痛。请各位高手指点指点。我用国产大鼠淋巴细胞分离液分离大鼠外周血，分离后三层界面中，分离液层浑浊，单个核细胞层呈絮状，而分离骨髓却很好，不知是哪里出了问题？不知取抗凝血后需静止后再对倍稀释吗？另外怎样克服小黑虫的污染？
我做了一次用Histopaque-1083液分离大鼠外周血单个核细胞的实验，用肝素预处理注射器，抽取腹主动脉血5ml,用5ml的hanks液稀释后，缓慢加入到含有10ml淋巴分离液的离心管中，使血液和分离液之间有明显的分界面。3000r/min离心20min后，可以看到试管中液体明显的分为4层：底层为红细胞，向上依次是淋巴分离液，单个核细胞和稀释的血浆。效果还可以，不妨再试一试。
VEGF的常用浓度10ng/ml,国外有些报道最多可加入50ng/ml,此时细胞分化较快,我用的是10ng/ml,效果还可以
回复zichuanxu ,FN用PBS稀释至1ng/uL,后包被24孔板,每孔加入100uL.置于37度培养箱中2h后.轻轻吸去孔板表面多余液体,再用PBS冲洗两次即可,但应该尽快利用,否则待FN干掉后就失效了.
我刚刚养大鼠骨髓的EPC，由于经费紧张，很是郁闷。我用的M199培养液加了VEGF和BFGF，密度梯度离心。一个孔里7天时出现了类似内皮细胞但要瘦一点的细胞，但到10天时又变成了多角形细胞基本脱离了内皮细胞的样子；另外一个孔一直都是多角形细胞，15天了还那样；况且细胞密度很低，每个孔里就两小簇。请高手指点是怎么回事。不会是间充质干细胞吧？？
首先声明是新手，所以提点拙见。我们有时候是应用EPC的增殖潜力，但培养过程中都逐渐分化成了内皮细胞了，包括国内很多文章题目写的是EPC但基本上都诱导成内皮细胞了。所以，如何才能保持在EPC阶段？？请高手指点，谢谢！！！可能这样更有意义一点
大家好：
我现在细胞养的还可以，用lectin UEA-1.染色基本95%为阳性，但还想用DiI- AcLDL鉴定，但是DiI-associated AcLDL需要量不多，而且卖的包装都比较大而且不便宜，我们实验室有不少lectin UEA-1.希望于园子里养epc的战友交换或者买点小剂量的，希望大家帮帮忙
谢谢！
回复exploiter001：我也有这种疑惑，是不是内皮祖细胞在培养的过程中仍然可以保持其原有的增殖特性。我需要的是内皮祖细胞，然后转染基因，移植到大鼠体肾脏内，所以真担心，最后得到的是内皮细胞，而不是内皮祖细胞。要是像战友说得那样，我真的就麻烦了！
我想请教大家一个问题：请多赐教！我们可以通过三色流式分析纯化自己所养的单个核细胞得到内皮祖细胞。CD31可以买到荧光标记的一抗，但是CD133和CD34只能买一抗和荧光标记的二抗。如果CD34的一抗是兔抗鼠的，CD133的一抗还可以用兔抗鼠的吗？大家知道通用型的荧光标记的二抗（抗兔）可以与CD34和CD133的一抗结合，我们就没有办法再区分细胞到底是表达CD34还是CD133了，也就无法区分细胞到底是内皮细胞还是内皮祖细胞！是不是CD34和CD133的一抗要买不同的动物来源，二抗也要随之改变呢（比如CD34的一抗是兔抗鼠，CD133的一抗就用驴抗鼠的）？
现在我很着急， 不知道怎么办，请哪位高手指点一下！！！！！
请问zichuanxu，你是怎么样鉴定大鼠的EPC，好象没有大鼠CD133和CD34卖啊。
REPLY大家好：
我现在细胞养的还可以，用lectin UEA-1.染色基本95%为阳性，但还想用DiI- AcLDL鉴定，但是DiI-associated AcLDL需要量不多，而且卖的包装都比较大而且不便宜，我们实验室有不少lectin UEA-1.希望于园子里养epc的战友交换或者买点小剂量的，希望大家帮帮忙
谢谢！
rosemimi 战友, 不知你在哪里做实验,我刚订DiI-acLDL,确实贵(4000.00),也没敢订FITC-UEA,如有需要,可与我联系:wyb155@163.com
To wux1 :我们买的是兔抗大鼠的CD133和CD34，现在试剂还没有到，但是已经通过晶美公司预定了！
zichuanxu,你太厉害了,我找了好久都没有找到,最后放弃了,改做小鼠的了.可以说一下价格如何,你是在哪的吗?以后多多交流交流.我曾在生理学报看到国内做内皮最牛的实验室发表过一篇文章中有关大鼠的,想问他们是用人的,还是用抗大鼠抗体,但给他们打电话,他们说从来没有做过大鼠的.不知道是这么回事,是要保密吗?
大家好，我准备做人的EPC，好容易找到了一个通道合适的抗体，但他们问我要哪个型号的CD133/1(AC133)和CD133/2(293C3)？晕！（当时手里要是有一枚硬币就好了！）请教各位：有什么区别啊？如果能带上参考文献就更好了！谢谢！
请教版块中养EPC的同道两个问题：
1。我养的EPC为什么到第7天细胞就开始死亡了，并且细胞数明显减少，我用的接种浓度为1.7*10的6次方/ml，是不是接种密度太低的缘故？
2。我每孔加的是1ml的细胞悬液进行培养，但等细胞贴壁以后，我发现培养孔中间的细胞密度明显较四周要低，请问是因为因为孵育过程中培养液蒸发引起的？细胞计数是是应该选取培养孔中间区域呢还是选细胞密度相对较大的周边区域？
请有经验的同道赐教，小小鸟先在这里谢谢了！
大家好：
我现在细胞养的还可以，用lectin UEA-1.染色基本95%为阳性，但还想用DiI- AcLDL鉴定，但是需要量不多，而且卖的包装都比较大而且不便宜，我们实验室有不少lectin UEA-1.希望于园子里养epc的战友交换或者买点小剂量的，希望大家帮帮忙
园子里有没有人有DiI-associated AcLDL？希望有的人和我联系吧，真的很需要，我们可以购买，只是需要的量不多，也可以交换，我们有生长因子和lectin UEA-1
谢谢！
lanyong73 wrote:
REPLY大家好：
我现在细胞养的还可以，用lectin UEA-1.染色基本95%为阳性，但还想用DiI- AcLDL鉴定，但是DiI-associated AcLDL需要量不多，而且卖的包装都比较大而且不便宜，我们实验室有不少lectin UEA-1.希望于园子里养epc的战友交换或者买点小剂量的，希望大家帮帮忙
谢谢！
rosemimi 战友, 不知你在哪里做实验,我刚订DiI-acLDL,确实贵(4000.00),也没敢订FITC-UEA,如有需要,可与我联系:wyb155@163.com
怎么没人帮我解答问题啊？哪位好心人帮帮忙！
怎么没人帮我解答问题啊？哪位好心人帮帮忙！
小小鸟 wrote:
请教版块中养EPC的同道两个问题：
1。我养的EPC为什么到第7天细胞就开始死亡了，并且细胞数明显减少，我用的接种浓度为1.7*10的6次方/ml，是不是接种密度太低的缘故？
2。我每孔加的是1ml的细胞悬液进行培养，但等细胞贴壁以后，我发现培养孔中间的细胞密度明显较四周要低，请问是因为因为孵育过程中培养液蒸发引起的？细胞计数是是应该选取培养孔中间区域呢还是选细胞密度相对较大的周边区域？
请有经验的同道赐教，小小鸟先在这里谢谢了！
1.接种密度是个数/cm2,个人经验是3~4*106/cm2比较合适,容易形成集落.
2.铺板要均匀,适当提高细胞接种时的密度.接种细胞悬液时注意枪头贴壁加,多个方向,不要直接朝孔中间打.
细胞计数尽量在孔内细胞密度较均匀的情况下做,选取各个方向随机的视野,并且所选取视野的细胞密度尽量一致.
个人意见,仅供参考.
多谢破伤风斑竹指教，受益非浅啊！
今天观察细胞时又发现一个新的问题：
我的细胞现在培养到第11天，前几天的梭形细胞非常明显，也可见数十个细胞呈放射状生长，今天再次观察的时候发现原先的梭形细胞几乎都看不见了，所有的细胞都变成了圆形，且有的细胞变大了，不知道这是否属于正常现象？
harry158:
你好，我也打不开下面这篇综述，能否发一份到邮箱(hailang001112@sina.com)
综述 <Unresolved questions, changing definitions, and novel paradigms for defining endothelial progenitor cells >
(blood ,106,1525-1531).
万分感激！
留email索取资源是论坛禁止的行为,提倡大家通过PM联系战友
如何PM
harry158:
你好，我是新手，刚要开始作EPC，我也想要<Unresolved questions, changing definitions, and novel paradigms for defining endothelial progenitor cells >(blood ,106,1525-1531)这篇文章，我的邮箱是yanglong1001@163.com
拜托！！谢谢！！！！！！
留email索取资源是论坛禁止的行为,提倡大家通过PM联系战友
如何PM
请教各位前辈：
血清那个公司的好一些？谢谢！
请教各位专家，有知道用内皮细胞做细胞毒性反应的可行性有多大吗？若用培养的内皮祖细胞将其转化为内皮细胞再行细胞毒性反应试验科学吗？多谢！
请那位好心人告诉我怎样才能买到EBM-2。万分感谢！！！！
icecream80 wrote:
EPC没听说有细胞株啊,EPC当然也存在免疫原性了.
真的吗?一直没有听说啊.哪里可以买到啊?热切期待答复
求教：
请那位战友告诉我，EPC培养基中营不应该加L－谷氨酸钠？多少浓度为宜？谢谢！！
对不起，上一条中L－谷氨酸钠应为L-谷氨酰胺，写的时候脑袋晕了。让方家见笑了
请教各位前辈：
人外周血EPC是不是贴壁的？细胞形态怎样？有谁有人外周血EPC的照片，上传一张让大家见识见识。都养了一个月了，也没有见到EPC，快闷死了
之前发过的,图1示外周血EPC细胞集落,源自
Granulocyte Colony-Stimulating Factor Mobilizes Functional Endothelial Progenitor Cells in Patients With Coronary Artery Disease"(Arterioscler Thromb Vasc Biol. 2005;25:296-301.)
图2示外周血EPC荧光双染色,源自
Number and Migratory Activity of Circulating Endothelial Progenitor Cells Inversely Correlate With Risk Factors for Coronary Artery Disease(Vasa et al.)
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