【求助】共聚焦样品制备中多重染色的步骤???急

各位战友,我下面实验要用共聚焦进行检测处理因素后细胞内两个分子的改变.同时还有一个用来表示细胞极化后头尾端的分子.两个一抗分别是鼠和兔,二抗还没有确定用什么标记的,一个FITC标记的CD43.
共聚焦扫描之后进行重叠.现在不知道加一抗二抗的顺序,是1)一抗----二抗------PBS 洗------一抗-----二抗------洗-----一抗---二抗---洗这样顺序的加,还是2)一抗一起加-----二抗一起加,或者,3)一抗分开顺序加之后在二抗顺序加?现在正在迷茫啊!请各位高手指点啊!

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