我培养近2天时去除了上悬液继续培养的，好像与培养4天才换液的效果相近。
请教版主：
我培养epc条件为M199包含20%FBS（GIBCO特优级）、VEGF, IGF,bFGF,EGF，在7-10天细胞生长、增殖旺盛，以梭形细胞为主。之后梭形细胞开始死亡，至13天超过一半，余者生机黯淡。从形态看符合“老死”。此时卵圆形细胞数量仍较少。
请问：1.有人言及自己培养的细胞在4-7天时细胞生长、增殖旺盛，就可行传代，我的细胞是否增殖太慢？可能原因为何？
2.在细胞不满60-70%是否可以传代？如此传代合适吗?传代后的细胞是否增殖更快？
先行谢过！
再请教版主：
有人建议培养基中加入丙酮酸钠、转铁蛋白、胰岛素和维生素c，不知可行否？
你好yanglong1001站友，说些个人愚见：
1.根据你的发帖内容估计你还是没养出晚期EPC，这个方法是有点不同与早期EPC的培养方法，其实在这个讨论区的首帖里就提到2种培养方法，现在想想可能就是早期和晚期EPC的区别，站友不妨可以先看看。（文献已经上传，见我的签名档SOS，文件名EPC）
还有篇发表在BLOOD上得经典综述《Unresolved questions, changing definitions, and novel paradigms for defining endothelial progenitor cells》，暂时找不到，稍后上传，文件名EPC2.
2.不用这么早传代，晚期EPC养出来后长得很快，长到90％是绝对不成问题。
3.这些之类得东西我们都没用过，好像文献上也都没提到
供参考，GOOD LUCK～
请问各位战友：我的实验计划是在EPC中加入药物，观察药物对细胞的干预效果，目前细胞培养在培养瓶中，需要消化至培养板中。在细胞加药前是否要血清饥饿以同步化，饥饿后细胞会不会很难消化而且对细胞的打击太大？饥饿在第六天，消化在第七天进行是否合理？还有我既要测增殖、又要测上清NO，接种在24孔中好还是96孔中好？还是两者皆有好？多谢多谢。
To yanglong1001:原代培养细胞的首次传代是建立细胞系的关键步骤，因此必须特别注意：（1）细胞没有长满瓶底的80-90％不要急于传代，否则细胞生长会减慢，也算是欲速则不达吧！（2）EPCs原代培养为混合细胞群，需要特别注意消化的时间。（3）首次传代接种的密度宜大，这样细胞可以尽快适应新的环境，因而有利于细胞生存和增殖！
感谢版主，上传文件我已收到。
谢谢zichuanxu战友，我培养的人外周血epc还没有进行传代就开始死亡，这是目前头痛的问题，能否指点其中关键？我一定谨记战友的忠告以备将来采用。
zichuanxu wrote:
To yanglong1001:原代培养细胞的首次传代是建立细胞系的关键步骤，因此必须特别注意：（1）细胞没有长满瓶底的80-90％不要急于传代，否则细胞生长会减慢，也算是欲速则不达吧！（2）EPCs原代培养为混合细胞群，需要特别注意消化的时间。（3）首次传代接种的密度宜大，这样细胞可以尽快适应新的环境，因而有利于细胞生存和增殖！
zichuanxu战友：你好！能否告诉我你的培养条件？大概培养多少天可传代？传代时时卵圆形细胞为主呢还是其他形态的细胞为主？谢谢！
请教版主：
我遇到了同virginiayq 相同的问题，我做的也是脐血来源的epc，用密度梯度离心后红细胞还是特别的多，请问用什么方法可以去掉红细胞，我相信这个问题很多人都碰到过，可文献资料中却很少有人提到。这个问题已经困扰我好一阵子了，敬请版主指点一二，本人将感激不尽！！！！
To yanglong1001战友，你好。骨髓来源的单个核细胞在M199培养基中进行培养。培养基没有你的细胞培养基营养丰富，培养瓶未用FN包被。只含有VEGF，bFGF和20％的FBS，我一般在第四天时去掉未贴壁细胞，贴壁细胞继续培养，每三天换液一次。一般在第十天左右可以长到80％融合，即使没有80％融合（一般为70％），局部细胞集落的细胞密度已复合传代要求，可以传代。只是传代时消化的时间要控制好，最好不要加EDTA，只用胰蛋白酶就可以了，否则子代细胞贴壁很困难（可能是我消化后细胞没有洗涤干净的原因）！但是还是建议不要用EDTA。
brightor wrote:
请教版主：
我遇到了同virginiayq 相同的问题，我做的也是脐血来源的epc，用密度梯度离心后红细胞还是特别的多，请问用什么方法可以去掉红细胞，我相信这个问题很多人都碰到过，可文献资料中却很少有人提到。这个问题已经困扰我好一阵子了，敬请版主指点一二，本人将感激不尽！！！！
这个问题记得以前有站友讨论过了，站友要会搜索哦，用羟乙基淀粉，一种代血浆，问麻醉科的就知道了，使用时按脐血量的1/6～1/4加或再多点。
zichuanxu站友，我们消化EPC时都加EDTA的，不然感觉很难消化下来
zichuanxu战友：非常感谢你提供的经验。但我养的是人外周血源的epc，有同道的经验是感觉比骨髓的难养。 我没有养骨髓的经验，不知道和外周血epc饲养方面的异同（文献毕竟代替不了经验，但经验常常需要代价----也就主要是钱）。
我为血源问题很头痛。有人用血站采献血者血所分离的白细胞来分离epc，这样可保证epc较多数量。但这类血多不新鲜，常常隔夜，似乎不利于epc存活。希望各位战友在这方面提供点宝贵经验，谢......
wzmc225 斑竹你好，我知道消化EPCs时如果不用EDTA，实在是困难，这个问题我也遇到过。但是自从我加了EDTA后，细胞的贴壁情况就很差了。所以我宁可用细胞刮刀强行分离，也不愿意用EDTA消化液！只是个人体会，斑竹和各位战友如果有更好的方法和经验，大家一起分享啊！
1.先转一个帖子到这里，各位可以先看看：
【请教】有关内皮祖细胞消化的一个问题
>
EPC加EDTA消化，我都是洗2次的，所以主观上感觉细胞贴壁还好。
2.yanglong1001 站友，做人外周血，来源确实是个很困难的事情，一开始可以先抽自己的试试下（唉，中国的研究生实在是太伟大了。。。），之后如果撇开伦理道德之类问题，可以去医院碰碰运气，其实做外周血其血源最好是“新鲜”的，也就是说最好4个小时内做掉。
to yanglong:
看到你的照片上背景中有一些黑色的点状物，是什么？
我分离的是大鼠的外周血，接种第2天就可以看到N多黑色点状物，培养基不变色。
做了好多次都这样～～
郁闷啊～～
各位高手指教一下吧～～
清风流香 wrote:
to yanglong:
看到你的照片上背景中有一些黑色的点状物，是什么？
我分离的是大鼠的外周血，接种第2天就可以看到N多黑色点状物，培养基不变色。
做了好多次都这样～～
郁闷啊～～
各位高手指教一下吧～～
高倍镜下的黑色点状物大多是杂质，可能是细胞碎片之类的吧。
得清风流香战友提醒，我刚才看了一下，大量的小黑点，大小不均，少部分还在不停动弹---似有生命。在配好的培养基中（有血清和几种生长因子）也看见相同的小黑点，但只是偶见，也在动。同室同学用的是我的血清养间充质干细胞，未发现小黑点。再看用纤维连接蛋白加M199培养基包被的培养板，无此现象。记得有人说过，不好的血清里可能有什么虫（-----黑胶虫？）但我的血清可排除。好像中学的物理教材中提到“布朗运动------无规律运动”，是不是杂质在其中作布朗运动？请各位释疑。谢谢！！！
贴一张偶滴细胞～～惨！
接种后24小时就这个样子了！
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清风流香 wrote:
贴一张偶滴细胞～～惨！
接种后24小时就这个样子了！
我的与你的很像。
清风流香 wrote:
贴一张偶滴细胞～～惨！
接种后24小时就这个样子了！
战友，你好，可以把显微镜的放大倍数调整到400倍，这样细胞的形态就可以看得更加清楚，有什么问题大家也可以一起讨论，共同进步！你的图片的放大倍数实在是太小，看不清楚啊！我以前上传了一张接种24h后的细胞的图片，后来细胞长得也还不错！
请问大家祖细胞一般养在培养瓶里还是培养板里？一般的接种密度是多少？有人说是6×10^6，但是我在实验时加得相对少的培养孔或者培养瓶反而细胞长得很好，密度达到那样的水平虽然集落很多，但是发现和低密度接种消化下来的细胞差不多
zichuanxu wrote:
战友，你好，可以把显微镜的放大倍数调整到400倍，这样细胞的形态就可以看得更加清楚，有什么问题大家也可以一起讨论，共同进步！你的图片的放大倍数实在是太小，看不清楚啊！
哦，忘了说明，这就是400倍滴～
我打算明天再做一次看看！
请问各位战友：将EPC从24孔板转移到6孔板需要重新包被FN吗?我的细胞可能需要转移地方，不知道贴壁是不是又成为问题，谢谢各位！
wzmc225 wrote:
这个问题记得以前有站友讨论过了，站友要会搜索哦，用羟乙基淀粉，一种代血浆，问麻醉科的就知道了，使用时按脐血量的1/6～1/4加或再多点。
zichuanxu站友，我们消化EPC时都加EDTA的，不然感觉很难消化下来
谢谢版主的提示，我现在已经得到了羟乙基淀粉，等待下次做原代用一下看看效果。
七月西藏 wrote:
请问各位战友：将EPC从24孔板转移到6孔板需要重新包被FN吗?我的细胞可能需要转移地方，不知道贴壁是不是又成为问题，谢谢各位！
FN作为细胞外基质（ECM）成分之一，含有能被细胞整合素识别的RGD序列起支架和黏附作用，并调节细胞间及细胞与ECM之间的作用，FN在细胞的早期识别与黏附中有重要作用，因此如果6孔板是新板可以不用FN，但最好还是铺FN的，因为国外有些报道说：FN本身也可以促进epc增殖、分化。[color=Crimson][/color]
请教各位战友：
我在用vegf、bpe等因子养了三天后做流式，结果发现CD31阳性为14％而CD34表达量为零，我是用密度剃度离心后养的MNCs，不知是什么原因，愿各位战友没给一下宝贵的意见，小弟在此谢过了！
昨天我自己抽了十毫升血分了一下，最后得到了1*10的六次方个细胞每毫升的单个核细胞悬液20毫升，比上一次做的细胞量整整多了三倍，不知为什么。
另外想请教大家一个问题，在将单个核细胞悬液接种24孔板之前，把板里包被的FN吸出以后，大家用不用PBS或培养基洗涤培养板？昨天我用M199洗了一下培养板（把M199加到板里然后就计数细胞去了，计数完了才把它吸走），现在想想有点担心，我会不会做错了？这样会不会使FN丢失，影响细胞贴壁？
还有，大家往24孔板每个孔里加的细胞悬液是多少毫升？陈君柱教授的文献上写的是1ml，但是个人感觉加1ml似乎有点多啊。
不会不会，FN包被后是要PBS洗涤的
我用的是甲基纤维素来沉淀红细胞的，感觉很好用啊。甲基纤维素也很好配，5克甲基纤维素溶在100毫升的双蒸水中，这是甲基纤维素不好溶解，没有关系，直接高压灭菌后会发现变成白色的不透明的液体，然后放入4度冰箱中过夜，甲基纤维素就溶解了。
最近可能会做流式细胞议检测外周血内皮祖细胞，用CD34、CD133、VEGFR做三色标记，计数后能不能直接提取出来，成本怎样，哪位战友做过相关检测提题意见，谢谢啦！
清风流香 wrote:
贴一张偶滴细胞～～惨！
接种后24小时就这个样子了！
我做出来的更夸张，原代接种时即可看见满视野的“小虫子”，见下图。实验室的老师说是污染了，但是我把所用的液体都抽样培养了都是好好的，血液采的是我自己的。如果是操作过程中污染也不至于接种时就满视野都是啊！有人说这是血小板，我也怀疑是，但不敢肯定，还请高手指点一下！
（缩略图，点击图片链接看原图）
这张是400倍的，上面那张是200倍。这是细胞培养至第3天的照片
（缩略图，点击图片链接看原图）
所罗门 wrote:
这张是400倍的，上面那张是200倍。这是细胞培养至第3天的照片
我前面提到的“小虫”会动，有经验者认为是血清里污染的胶原虫。直接用血清涂片，枝细观察也发现小虫。若只是大量小碎片静止不动，应该不是污染。
我将所有的液体都抽样进行了培养，到现在已经48小时了，仍然未发现任何异常。有战友说那是未分离出去的血小板，我请教了有的前辈也说是血小板，今天我又重新做了一次，仍然有很多小点，椭圆形的，我现在也感觉应该是没有去除干净的血小板，因为操作污染不可能在接种时即看到满视野的这种东西，而所用的液体都是没有问题的，这个东西就只能是来源于血液的了。
说到这里，顺便想问一句：对于去除这些血小板，哪位前辈有什么好办法没有？
另外，我在培养过程当中见到细胞形成了这样的漩涡样结构，培养第一天即可看到，不知这是什么？哪位战友也出现过类似的情况没有？
（缩略图，点击图片链接看原图）
所罗门 wrote:
我做出来的更夸张，原代接种时即可看见满视野的“小虫子”，见下图。实验室的老师说是污染了，但是我把所用的液体都抽样培养了都是好好的，血液采的是我自己的。如果是操作过程中污染也不至于接种时就满视野都是啊！有人说这是血小板，我也怀疑是，但不敢肯定，还请高手指点一下！
你养的细胞里面有RBC还有血小板，你所说的小虫子很可能就是血小板，我原来也碰到过这种情况，如果你能把RBC分离干净的话，小虫子并不影响EPC的生长，且经过几次换液后会越来越少。别着急，不妨先等等看看，把接下来的实验先准备着。
