失败——思考——成功，这就是成长的故事。
前事不忘后事之师，show出你成长的故事，这比一句深刻的经验总结更能让人警醒，更能避免后人再犯同样的错误。
闻道有先后，术业有专攻！相信每个人都有自己的故事，相信你的故事肯定会帮到一部分战友，相信一定会有一定的意义的，能够帮到一个人您的回帖就是值得的。
故事比结论更能让人抓住问题的本质，更容易让人接受这个结论，所以更有教育意义，所以希望大家能尽量完整的讲述自己的故事！
我就先抛块砖头出来了，希望大家多多支持，踊跃发帖！
题目：质粒构建之酶切位点的选择
结论：一定要选择具有相同buffer的两个酶
技术背景：
克隆目的基因，并把其装入表达载体转化/转染原核细胞/真核细胞中，是获取目的蛋白/研究基因功能的经典方法，也是目前科研工作者常用的方法。其中酶切是该技术不可缺少的一部分，随着载体设计技术的发展，双酶切以其独特的优点而逐渐取代了单酶切 。
具体实验流程如下：
设计合成含有酶切位点，能扩增基因ORF全长的一对引物——PCR扩增目的基因——纯化PCR产物——分别对PCR产物及载体进行双酶切——分别纯化双酶切产物——连接目的基因与载体——转化大肠杆菌——筛选阳性克隆——质粒提取——转化/转染——获得重组蛋白/功能研究
酶切反应虽然是在PCR之后，但是酶的选择却是在PCR前引物设计时就完成了。我觉得这就是错误的根源！
故事：导师给我的第一个课题就是研究病毒包膜蛋白的功能，首先我需要克隆出该基因，并把它装入真核表达载体pcDNA3.1(+)，构建重组质粒。根据pcDNA3.1(+)载体多克隆位点的内切酶排列顺序，在设计引物时，我在上下游引物的5'端分别引入两个常用的便宜得内切酶：BamHI/XhoI。引物送公司合成后，就开始实验：PCR过程非常顺利，一下就把目的基因拉出来了。但是怎么也想不到，这个载体我忙了半年也没有构建成功。由于PCR后面的酶切，连接，转化试验都无法进行成功性的鉴定，试验只有拿单克隆细菌进行鉴定。可是我的平板上始终看不到有单克隆生长。所以错误可能出现在PCR后的任何一个环节。
下一步就是要找出错误发生在哪里！最容易的鉴定就是感受态细胞了，拿载体做了一个阳性对照，结果板上密布菌落。这说明感受态细胞以及转化的过程没有问题。
那问题很有可能出在两个地方：1.双酶切没有完全切开 2.连接没有成功！由于师兄用同样的两个酶有成功的先例，所以我主观判断是连接出了问题！判断的失误导致我浪费半年的时间：购买新的T4连接酶，不停的摸索连接条件，不停的更换目的基因与载体的比例，应用平端连接的连接体系.......半年时间就在痛苦的重复和思索中过去了。老板不得已给我更换了课题！后来实验室又要构建重组质粒，由于我“经验丰富”，老板把这个重任又交给了我。这次在设计引物时，无意中我更换了酶切位点（目的序列中含有XhoI的序列，不可用），选用HindIII/BamHI。实验结果出奇的顺利，两个星期内我就把测序鉴定正确的质粒大提后交给老板！
我反思：为什么我做了半年没做出来，而这次半月就搞定了呢，极有可能使酶切的问题：BamHI/XhoI没有共同的buffer，不管加入哪一种buffer，都有一种酶的活性只有50~70%，而HindIII/BamHI却有着共同的buffer，在双酶切体系中两个酶的活性都达到100%。
为了证明这一设想，我又重新设计引物，选用HindIII/BamHI这两个酶，结果被我一举拿下这个重组质粒！
之后，老板把实验室所有重组质粒的构建任务都交给了我，两年内我成功构建了8个重组质粒。
占个地方,以后补上
俺来唠叨一下.
做实验要学会与别人交流，转换思维，记住这句名言：条条大路通罗马
我以前构建过一个质粒，难点就在于片断两端都是EcoRI位点，片断长度2.8Kb，也算是大片断连接了。我是这样做的，载体分步酶切，然后碱性磷酸酶去磷酸化，然后就于片断进行连接反应，结果做了两个月都没做出来，每天都是重复性的工作，有一天老板问起了情况，说连接反应时不一定要使用连接酶说明书上介绍的方法，交了我一种连接方法，步骤如下：
载体 0.5微升
片断 5微升 （载体：片断 1：10 片断量要高些）
Ligase buffer 5微升
T4DNA ligase 1微升
ddH2O 38.5微升
总反应体积50微升。
把反应夜放在冰上，将冰块连带反应夜室温下放过夜，第二天,用酚氯仿抽提，然后用2倍体积乙醇和1/10体积的3M NaAc沉淀，沉淀用70乙醇洗涤，自然条件下风干，沉淀用10微升TE溶解，取5微升进行转化。
结果一下就作出来了阳性克隆。
所以，我想说的是，大家要多与人交流，标准的做法不见得是最好的方法，当一条路行不通时，你可能会发现另一条光明大道。
啊，啊！没有什么经验，做试验都很顺利，郁闷！唯一的一次不顺利反复看老板给的资料，然后发现老板把一条序列给搞反了，所以一条引物也反了，导致试验不利。所以有时候老板给的东西也要反复检查，尤其试验不顺利的时候。像LZ说的那些个试验其实都是很容易的，各个环境一般有问题的可能性比较小（因为只是克隆一条很短的序列，而且成万中一就成功了！），很多时候出在试验设计上。现在毕业了，自己开张了一个实验室，什么都要自己搞定，设备、试剂、课题设计。。。
---——
这样斑竹也给偶甲酚，实在惭愧呀，这不是逼偶写一个好的帖子嘛？好，改天整一贴上来，聊表偶得一分之惭愧心理！
有分加，我也来凑个热闹！
我是做细菌方面的，最近在实验室忙了半个月，来谈谈吧
感想一：做实验不能急，一定要耐心，有的时候急着去吃饭（怕晚了饭堂没吃的了）匆匆的做实验，效果极其不好，反而要重做，所谓宁停一分不抢一秒，很有道理。做不好重做的话不仅是浪费东西又耗时间还影响心情。
感想二：练好基本工（做细菌的就是划平板、染色等操作）。练好基本工能达到事半功倍的效果。本人曾经划板的水平相当的差，分个单菌落都花了好长一段时间。基本工练到一定程度就会悟出些技巧，比如挑菌划平板的时候，要掌握好度不然分出的单菌落会比较少，长出很多大菌落。染色的过程脱色是关键。
感想三：要有反复实验的心理准备。有的时候，除了主观操作的原因还会有些客观的原因，比如我试过养标准株（冻干奶粉保存的），开始养不出来，后来发现是标准株的浓度太低要挑多一些的干粉才能养出。所以要大胆的构想，小心求证。
感想四：要做好记录，理好思路，每天从实验室回来的时候要想好明天要做什么，最好些在笔记本上。尤其是配液配平板这些要早些准备好，不然到用的时候就没得用，很不方便。
感想四：我发现染色看似简单，其实中间还很多的问题。有的时候阳性染成阴性，阴性染成阳性（以前有个帖子有讨论过这个问题的），的确是这样子的。我 个人的总结是：1菌不能太老才来染色，菌活性降低会有些形态染色上的变化。2、我做革兰氏染色时发现，染完每一液后一定要把冲洗液甩干净，不然加下一液的时候就会把染液稀释掉，结果就不一定与事实相一致。比如，酒精被稀释后会导致脱色不全，阴性变阳性。
另外我还发现，买来的标准株不一定是纯的，我就遇到过这个问题，我要的是阴性杆菌但里面混了很多阳性球菌。我实验室其他的同学也遇到过这种问题
就这么多，以后再有其他感想再说
迷北方的狼 wrote:
结论：一定要选择具有相同buffer的两个酶
我反思：为什么我做了半年没做出来，而这次半月就搞定了呢，极有可能使酶切的问题：BamHI/XhoI没有共同的buffer，不管加入哪一种buffer，都有一种酶的活性只有50~70%，而HindIII/BamHI却有着共同的buffer，在双酶切体系中两个酶的活性都达到100%。
为了证明这一设想，我又重新设计引物，选用HindIII/BamHI这两个酶，结果被我一举拿下这个重组质粒！
对于这一点，我有不同的看法，当然能选择到具有相同的通用buffer是最好的，这样可以保证酶切效率。但是有时候我们实验的具体情况并不是像我们想象的那样。比如有时候从老外要来的质粒。他们只告诉你那个质粒两三个酶切位点，以及位点之间的片断大小。方便你对质粒进行鉴定。这个时候如果你想把这个质粒上的片断导如另外一个质粒，挑选酶切位点就不那么顺利了。对于这种情况（buffer 不同），我们不是没有办法的。我的经验是1、分别对每个位点进行单酶切，然后再纯化；2、延长酶切时间，有的酶推荐的酶切时间是1小时，我们可以灵活的把酶切时间延长到酶切过夜。
个人观点，仅供参考！！呵呵！
相应斑竹号召！
我来谈一下，本科毕业的时候在一个做植物的实验室做毕业论文，带我的师姐交给我一项任务：把转化植物的双元载体转化农杆菌GV3101，然后要我培养，两天后离心下来，重悬，再交给他。特别告诉我注意防止污染，因为这个菌要摇两天。要我独立做，不懂再问她。
结果我离心下来后菌有点带红色，而且很臭。我想肯定是污染了，把它洗得干干净净的，结果当然犯错了，还好师姐很宽容，很耐心。
虽然我现在不接触这种菌了，但对它的这个特点恐怕一辈子都忘不了。
后来做酿酒酵母，哇，好香，酒味很浓的。
教训：一定要搞清楚材料的特性。知己知彼，百战不殆嘛。
morgan1980 wrote:
但是有时候我们实验的具体情况并不是像我们想象的那样。比如有时候从老外要来的质粒。他们只告诉你那个质粒两三个酶切位点，以及位点之间的片断大小。方便你对质粒进行鉴定。这个时候如果你想把这个质粒上的片断导如另外一个质粒，挑选酶切位点就不那么顺利了。
我做过两个质粒都是把一个质粒中的目的片断插入到pCDNA3.1中，也同样遇到酶切的问题。我是通过设计一对引物引入自己选择的合适的酶切位点，通过PCR的方法获得目的基因，在通过双酶切，连接到载体上。
虽然比直接酶切质粒获得目的片段的方法复杂些，不过在有些情况下——比如没有适合的酶切位点、两个酶没有共同的buffer——这种方法会更顺利。因为以质粒做模板时，对引物的要求不是很高，也就是很容易就能扩增出目的片断，实验步骤多了，但成功率也更高了！
呵呵，好久没来园子里了，我是做微生物发酵方面的。我也说个小故事。
一次偷懒，晚上做好的纤维素水解液没有及时处理（因为考虑到酸性很强pH 值小于1.0）。第二天早上也没有记起，等到晚上想用时一看，里面的液体都变混浊了，当时本想一扔了事，旁边一师弟却很惊奇的拿过去说，什么菌能在这种条件下生长啊？一句话提醒了我，于是采取划线分离，挑单菌落。除了有霉菌，居然还发现一株和我当时用的菌的形态很相识的（酵母菌，有颜色）。后来经过鉴定这株菌就是我一直用的那株菌，经过这件事，事后又有目的的在水解液中反复驯化了这株菌，最终得到了用于后来实验的菌。
得出结论：实验中一定要细心，偶尔偷懒也不一定是坏事噢：）
题目：血的教训之导师的选择
故事：
本人硕士期间就读于TJ某高校药学院。本就是国内名校，01年更是花大价钱从美国多所名校一次引进十余位学有所成的海归，在某位大牛的带领下组建了药学院。学校重视度之高，学生反映之好，一时为学校之最。好多同学也以是该学院的学生而自豪。而本人也就是在这种情况下挑灯夜战半年“幸运的”成为了该学院的一名硕士研究生，并成为一位大牛的入室弟子。该大牛16岁考入北大，后在Columbia 读博士学位，而师公（就是老板的老板啦）还是一位Nobel Prize得主。大牛本人也曾发表过两篇science。一时俺的眼里满是幸福的泡泡（后证实是肥皂泡！）。
然而“祸兮福之所倚,福兮祸之所伏”这条该死的唯心主义的明言开始发挥了他传说中的威力。该大牛回国的唯一目的就是开公司赚钱，在学校挂名一为名二为利，一来可以显示自己公司有多么深厚的技术背景，二来可以申请更多的国家支柱。至于学校中学生的生死则不在他的考虑范围内。他在给我布置课题是只说过一句话：听说有一种具有杀菌活性的多聚高分子化合物可以参入油漆中涂在公共场合的门把手上，减少细菌感染，你查一下这方面的资料，找人合成一下，然后测它的抗菌活性吧。然后再无任何指导。本人是在接手课题近半年后才明白课题的真正内容的。在购买仪器时，他长时间又不置可否。本人自知无法毕业就在入学一年半后主动选择了调剂到别的导师门下，后延期半年毕业。
想说的话：不知道大家对自己的导师如何评价。虽然师傅引进门修行在个人，但是作为导师，在学生的学术生涯中起了非常重要的引路人的作用，他们是应该承担一定的承认和培养学生的义务，这是师德。起码有如下可以参考的标准：
1 品格
2 科学精神
3 科学头脑，主要是对该领域或整个科学发展方向的把握
4 科研能力 是否有独到的眼力选择很好的方向进行研究
5 对学生研究方向的把握， 指导。
这直接决定你是否能通过几年的学习成为一个合格的科研工作者。当然自身的努力很重要，但是如果有一个出色的导师直接指导你去学会如何搞科研，培养科学的头脑，我想你的科研之路也就成功了一半。
本人深信绝大多数的导师仍是社会的脊梁，学生的楷模；但也深信学术***是肯定存在的。大多数导师会真心为学生考虑，但也不乏有些导师为了自己的私利会毫不犹豫的牺牲学生。希望自己的经历能引起兄弟们的警惕！时世造英雄，一个好的导师，好的环境会把你的学术生涯的成功率提高很多倍！
迷北方的狼 wrote:
我做过两个质粒都是把一个质粒中的目的片断插入到pCDNA3.1中，也同样遇到酶切的问题。我是通过设计一对引物引入自己选择的合适的酶切位点，通过PCR的方法获得目的基因，在通过双酶切，连接到载体上。
虽然比直接酶切质粒获得目的片段的方法复杂些，不过在有些情况下——比如没有适合的酶切位点、两个酶没有共同的buffer——这种方法会更顺利。因为以质粒做模板时，对引物的要求不是很高，也就是很容易就能扩增出目的片断，实验步骤多了，但成功率也更高了！
这种方法的确是个好办法，我也用过，但是有时候老外给你质粒信息非常少，只告诉你两个酶切位点，以及切下来的片断大小，供鉴定用。其他的信息都没有（我就遇到这种情况），没有序列你怎么设计引物呢？并且你设计引物的时候难免会带入一些不必要的新的序列，很有可能会影响你的结果，如果是表达质粒，那么有可能带入新的氨基酸序列，甚至造成移码，如果是luciferase质粒就更麻烦了，很有可能引入新的转录因子结合位点，最后你都不知道结果是怎么来的。所以有的时候还是要看具体情况啊，我觉得最好不用设计引物的办法，以避免带入新的不必要的序列。
大家多多讨论，共同进步！！
我的观点: 量化
据我感觉,许多生物学科的研究者对定量都没有一个强烈的印象.
许多实验只有有阳性或正结果就行. 但在这一过程中,却花费的大量的时间和精力.
从业这么多年,我感觉非学有必要建立量化这一概念,并指导自已的实验工作.
遗憾的是很多人都不接受. 一次结果不出来,反复摸索,有时无章法，无头绪．
就事论事：
上面一个朋友sunyongjun提到了一个连接反应过程．我认为这是一个很简单的操作．用不着用那位朋友所写的奇怪程序．
个人观点如下：
1, 感受态效率怎样（１０e5, 10e6, 10e7, 10e8?）
2, 载体和外源片段EcoRI酶要时量多大，纯度如何？
3, 连接反应载体和外源片段用量多少，纯度如何？
上面朋友所碰到的问题是自连现象特别严重．但我认为在以下前提下问题可迎面而解．
１，感受态效率稳定有１０e７以上；
２，ＰＣＲ产物和载体酶切充分（如100ul vol, ＰＣＲ产物0.5-１ug, EcoR15-20U, 反应３h; 载体２ug, EcoR15-20U, 反应３h）,酶切产物最好胶回收纯化．
剩下的工作是摸索外源片段和载体的mol比，由于外源片段较大，刚开始就应考虑３：１以上的值．其实，我认为４：１也就够了．
上述为我个人的观点：
上述为我个人的方案，解决了纯末端连接等问题．
我的观点: 量化
据我感觉,许多生物学科的研究者对定量都没有一个强烈的印象.
许多实验只有有阳性或正结果就行. 但在这一过程中,却花费的大量的时间和精力.
从业这么多年,我感觉非学有必要建立量化这一概念,并指导自已的实验工作.
遗憾的是很多人都不接受. 一次结果不出来,反复摸索,有时无章法，无头绪．
就事论事：
上面一个朋友sunyongjun提到了一个连接反应过程．我认为这是一个很简单的操作．用不着用那位朋友所写的奇怪程序．
个人观点如下：
1, 感受态效率怎样（１０e5, 10e6, 10e7, 10e8?）
2, 载体和外源片段EcoRI酶要时量多大，纯度如何？
3, 连接反应载体和外源片段用量多少，纯度如何？
上面朋友所碰到的问题是自连现象特别严重．但我认为在以下前提下问题可迎面而解．
１，感受态效率稳定有１０e７以上；
２，ＰＣＲ产物和载体酶切充分（如100ul vol, ＰＣＲ产物0.5-１ug, EcoR15-20U, 反应３h; 载体２ug, EcoR15-20U, 反应３h）,酶切产物最好胶回收纯化．
剩下的工作是摸索外源片段和载体的mol比，由于外源片段较大，刚开始就应考虑３：１以上的值．其实，我认为４：１也就够了．
上述为我个人的观点：
上述为我个人的方案，解决了纯末端连接等问题．
我的一点感受！！
暑假在教研室帮助老师做实验，顺便转些钱混日子，那些天是我在大学里做实验的总和还多，每天早上七点开始，中午吃完饭继续，下午要到实验结束才能离开，经常开夜车，还好老板是提成的，做多少，拿多少，在那里我真正学到了一些东西，知道什么叫实验。有几点实验室的操作铁律和大家分享：
1、不知道的物品不要管，不管他看起来多碍眼。
在每天灌胃1个月后，我们的上海鼠终于到了大限。忙碌了2个多小时，200多实验鼠被处死，胸腺被取出剪碎，镜下观察计数，忙到现在，肚子唱起空城计了，老板大手一挥，所有人都到外面吃客饭。有位硕士生（新来的）吃的特别快，擦完嘴无聊就先到实验室。早上的实验“废物”都在台子上，我们的这位老兄也是勤快，该冲的冲（试管），该扔的扔，等大家吃完回到实验室，实验室干干净净。这下所有人都傻了，胸腺细胞计数后，要根据多少按比例进行其他操作，试管洗掉了，所有的东西都没用了，一个月的饲养白费了，几万大洋泡汤了，还要和客户解释，延迟实验结果的出具。我记的当时没人敢和老板说这件事情，最后让一位老板同学去说的。不过还好，老板只是着急上火了一下，就宽容了大家。仅说了一句“下次大家记住教训”。这个教训我记到现在，所有新来的同事我都要说。
2、学历不代表能力。
做消毒剂效果评价的时候，大老板的一位博士生弟子要来和我们一起做，因为大老板是消毒领域的大牛，所以我们对这位师姐格外看中，况且我们只是小小的本科生，仅能做体力劳动活。实验开始后，真让人大跌眼镜，一些基本的操作也就是高中毕业都会的，这位大姐竟然不知怎么办好。到后来，大家在私下都说，这世道让人看不懂啊！
简单点，我是做生产的，有一段时间连续十几批罐单位下降，未查出原因，后经头头提醒，将近来的相关数据分类统计分析，与以前高单位的相对比，得出是移种时的干重和PH有叫大差异，且PH和干重相关联。
生产上平时要注意数据的统计分析！！
我做实验的教训：
1.做实验一定有对照。我初进实验室，老板让我做噬菌体，噬斑出现时因当时没有对照而前功尽弃
2.感性认识很重要。平板的噬斑每次都有，但富集培养总是不稳定，于是怀疑自己到底得到没？于是开始向做噬菌体和相对应菌的学校老师和医院的老师请教，最终医院的老师给我一张不同滴度的噬斑图才真正确信自己是对的
3.找高手帮忙。做电镜时，制备样品的老师说我噬菌体的滴度高，而负责电镜的老师告诉我说没有噬菌体，还问我你的噬菌体长啥样，我又没见过我只能参照文献中的图做简单解释，最终他还是告诉我说没有。第二次我找一个老师给我看，照片一出凡做微生物的都说是噬菌体，为何负责电镜的老师当时就是找不到呢？
记得进入实验室后，开始做的第一个实验就是连接转化。当时实验室人特别少，所有实验都要自己摸索。按照T4连接酶的说明书来做，连接完毕后，按照连接酶说明书进行连接产物的Buffer转换。用酚氯仿抽提，然后用2倍体积乙醇和1/10体积的3M NaAc沉淀，沉淀用70%乙醇洗涤，沉淀用TE溶解，转化。结果每次，作的时候都看不到沉淀，当时以为自己的操作有问题，重复了一周左右也没有结果。十分郁闷。问了一个师姐，她说：没有沉淀是正常的，因为你连接的质粒量比较少。可以不必纯化，用连接产物直接转化就可以了。现在一般的T载体连接试剂盒都是直接转化。当时我恍然大悟！·
建议：做试验时切不可盲干，否则弯路越走越多！碰到问题，多方求教解决了再继续，会事半功倍。
不知道算不算一稿多发啊^_^
偶是解析结构的，首先的目的是在基因组中找到合适大小、并且单体可溶、折叠的蛋白。
期间遇到过好多的问题。这里着重讲解一个：柳暗花明又一村，只要你更加坚持一下。
第一个月
从ncbi的蛋白库中筛选没有同源结构，并且大小合适的基因。需要和pdb参照
然后设计引物。
第二个月，将上面过程筛选的50个蛋白，进行pCR、双酶切、测序。并且转到表达菌株。
初步进行试表达情况。测序通过的有30个，表达的有20个。
第三个月，检查这20个蛋白的可溶、折叠、多聚等情况，简单的说就是是不是合适的用于结构NMR解析。发现只有一个情况比较 好。
第四月，由于，在真正解析之前需要坚持蛋白稳定情况。于是在常温下放置。发现一个星期候显著降解，信号很不好。
郁闷、郁闷、用了n多方法，仍无法使它稳定，这很可能意味这接近半年的时间，工作为0
怎么办
查文献和国外的大牛交流发现，别人也遇到这种情况，他们好多人就是重新做科隆，将蛋白在容易降解或者影响信号的地方切掉。我于是和老板商量之后，重新做克隆，于是发现一切都解决了，再把其中一个预测的loop切掉之后，蛋白非常稳定、信号非常好，而且分析发现，基本上二级结构没有任何的变化。现在文章已经开始修改了。
体会，当你真的觉得自己要绝望甚至要放弃的时候，告诉自己，一定可以有解决的办法的，坚持坚持，并和大牛或者老板讨论，或许真的就是柳暗花明又一村了。
我对微生物方面的东西知道的很少，我是做那种纯粹的分子生物学试验的人，因为研究生读书的研究所是中国最早的专业分子生物学研究所之一，前面我说过，我做试验很少失败（到现在真还没有什么失败的记忆）。当然，读书的时候有不懂的可以问，我们研究所一般的试验基本都有相当基础，后来工作后，也说过了，一切得自己操办。废话这多，得出做试验的一些教条主义为：
其一.对自己不熟悉的试验，在进行之前一定要把握方方面面的资料（包括看相关文献）和情况，可以在试验正式开始之前几天先想好有哪些试剂需要提前准备的（如是试剂盒则需要提前达一周，一月准备定购），当你“觉得”万事具备的时候，你可以在头脑中把整个试验过程想象着做一遍。这样你会发现其实还有很多细节问题没解决。我经常在回家的路上或洗澡、如厕和临睡前想试验和写标书的问题，效果奇佳，可以把所有的细节疏忽都想到。
其二.在开始做试验时刻起，你就应当养成一个好的试验习惯，尤其是无菌观念和操作必须非常强，不是说所有的试验都要求无菌，而是一旦真正需要无菌的时候，往往哪些无菌操作不熟练的人就会犯糊涂了。举个例子，÷偶曾有一博士师兄，做事慢慢腾腾，似乎稳稳妥妥，但是养细胞则经常污染，为何？因为他对究竟在哪个环节可能导致污染缺乏认识，所以把注意力分散在一些次要环节，而对真正的核心环节做得不到位。对RNA相关试验的操作对无菌观念也是一个挑战，如果你能做好大型RNA试验表明你无菌操作基本过关了。开启EP管的习惯和放枪的习惯都可以影响到你的无菌操作，疏忽不得。
其三.我说的这一点基本上少有人认识到，那就是做微观试验的宏观认识。分子生物学试验是微观而又微观的东西，任何一个结果必借助放大或媒介方能看到结果和效果，但是，我要提出的是，其实分子生物学试验是个极其宏观宏量的玩意，为什么这样说呢？我说的宏观是试验对象的量的宏观，抽提DNA时候的DNA分子，PCR试验中的扩增产物，蛋白质表达的分子数量，基因克隆中的载体和目的片断数量及随后的克隆菌落数量，太多了，我就不一一指出了，有心的看客可以自己思量，如果你对这些宏观的东西有了一定认识之后，你会发现很多分子生物学试验说来精细，其实粗糙的不行，而知道了这种粗糙你就知道虽然操作小有变化，试剂小有不同，方法小有创新，手法小有不同，污染小有存在，等等，其实结果可以大有一致，哈哈。也就是说只要你达到了一个range内，你的试验结果就是可以预期的了，不必紧张兮兮，我就是发现了这个才做试验无往不利的。举个例子，很多PCR小菜鸟把PCR看的神神秘秘，我在菜市场操作都可以出结果，呵呵。
其四.因为有了三，所以必然会出现四。我在理解三的基础上，对做试验基本都要进行一番“创新”，可以说，打从做试验的第一天，我就少有规规矩矩、本本分纷做试验的，所有的试验，如果我觉得有不妥，不够完善的地方我都按照自己的想法去做，去改进。比如早在2001年我就在我们实验室第一个自创菌落直接PCR，当然，或许别的实验室已有先例，但我是自己想到的。现在还有很多细菌文献里面的老外津津有味地写怎么怎么抽提DNA再做PCR，简直搞笑（金黄色葡萄球菌等个别革兰氏阳性菌例外哦）。做转化试验也不是按照操作说明做的，直接多涂布一些，菌落也做收集，摇床里面摇的时间则又缩短一些等等。『后补的一句：负责地告诉你，做这一点前您老必须掌握一定的分子生物学基本理论，理论是实践基础，切记切记！』
其五.当试验进展不顺的时候，千万不要盲目死做，必须停下来，回头反复看相关文献，看别人的方法，可以搜索或来DXY等论坛看看，有条件可以和别人讨论讨论，当然，这种事情我没什么经验，我的经验在试验之前就做了，这是为别人解决问题的时候用的最后一招。我身边有初学分子生物学试验的人，我会帮他解决一些试验中遇到的问题，那么怎么解决试验中的问题呢？我是这样想的，把问题基本从中间分成两部分，考虑可能从前半还是后半出问题。
我举三个例子。
第一个例子，我们实验室刚开张的时候我做PCR，结果没有任何结果。这个问题很麻烦啊，因为刚开张，任何一个环节试剂均有可能出问题，没有一项是确定没有问题的。那么你可以考虑是PCR本身出了问题还是电泳出了问题，电泳是否出了问题可以看Marker有无得出结论，结果Marker有条带，说明是PCR的问题，PCR的问题可能出在反应条件上、PCR仪上、模板的制备上或PCR体系上，反应条件回顾参考资料啦，确保没有弄错，参考文献权威；PCR的问题我暂时没办法解决；模板的制备可以再试试其它几种模板或浓度；然后在考虑反应体系上，哪些试剂浓度可能有问题，一般酶和缓冲液出问题可能性小，PCR七种玩意，最后只剩下dNTP，后来发现我把它的dNTPs浓度看成了单一一种的浓度，翻了四倍，导致试验失利。
第二个例子，同事做AFLP没结果，用的是试剂盒，也可把问题分成两段，前者试剂盒操作部分，AFLP的扩增；后者电泳。这个问题有点类似PCR问题，AFLP没结果，电泳有无问题先看Marker，当然，他这个试验两个问题都有，我先解决电泳问题呀，电泳可先只跑Marker直到出结果，我们限于条件只能用银染法，电泳本身出问题可能性小，多半是染色、脱色或显色哪个环节出了问题，一一试之啦，改变条件。解决了这个电泳的问题之后解决AFLP的问题，如果你对这个试验了解的话，应该知道它包括提取基因组DNA、酶切、接头连接和第一轮扩增和第二轮扩增（选择性扩增），DNA及其质量有无问题，酶切有无问题均可通过电泳看到，两轮扩增的话，我就让他直接跑个琼脂糖凝胶电泳，第一轮看不到，第二轮理论上是看得到的。
第三个问题，还是我这位同事啦，提取DNA的时候，预试验满好，大规模一提就没东西了，着急呀，怎么越来越退步了，呵呵。提取DNA如果有问题的话有哪几个步骤是关键的呢？细菌的菌量，选用的方案，细菌破壁是否充分，酚氯仿抽提有无问题这几个问题是最关键的，其它都属于小问题。酚氯仿有无问题看电泳，如果电泳什么都没有，更上游一定有问题，如果电泳点样孔有亮带，表明酚氯仿抽提有问题，蛋白质没抽提干净；选用的方案你就得重新看看程序本身有没有问题了，这个也不难解决；菌量和破壁两个问题因果相关，量大了破壁肯定不充分，量小的话破壁如果试剂没加错或浓度不过低应该没有问题，OK，就大量减少菌量来抽提，结果发现确实是菌量的问题。
题目：关注培养基质量，提高实验成功率。
结论：目前商品化的培养基第一次试验需要自己全面检测一下。
技术背景：使用浊度法测量抗生素效价，需要纯度、灵敏度均很高，代数少的细菌。
故事：有一段时间做比浊法效价测量，发现试验结果莫名奇妙的变差。主要表现为，细菌生长不均一，同浓度菌液培养所得吸光度相差很大。通过分析，能排除由于加样量差异、培养温度差异、所用培养皿差异等因素造成的影响。最终怀疑新更换的培养基有问题，结果测量灭菌后pH值比标示的低0.5左右，用NaOH调节pH值后，试验结果正常。
总结：目前由于培养基引起的细菌生长异常常常被忽视，经常做细菌培养的战友应该在新更换培养基的时候全面检测一下。
很有启发，支持一下
丁丁！！
实验设计异常重要
明年就要博士毕业了，现在手里有了2 SCI，趁此作为新成员的机会，顺借本楼主的光，将我的两点体会与大家分享：
1. 方向性，即开题，也就是意义问题，那么如何看文献，了解前沿呢？
我的感觉必须把本领域方向的文献真正看通，这里看文献主要是看Introduction and discussion，至于一些综述要看有影响力的。Introduction看后你会明白你要做的事情多莫有意义，而 discussion一般是作者真正遇到的困难或创新，这会对你的未来课题提供宝贵经验。
2. 具体实验的设计，也就是方法的问题了。
当然基本实验技术，有的是工具书就不必多言了。这里还是设计的问题，如何来做，此时不要一条道跑到黑，生物试验往往是失败再失败，甚至基本的载体构建都会拖你一两个月。此时要研究相关文献的methods and results。要看前人是如何设计的，要不断总结，到底哪种方法适合你，要研究细，否则一个小模糊会前功尽弃。另外，就是与他人交流了，不仅与师兄师姐，还要与其他同行，甚至是老外，一定要注意谦虚，礼貌，切记！
先到此吧，有机会再和各位大侠交流！祝各位试验顺利，心情愉快！！
我硕士已经毕业一年了，想想硕士期间真是空虚！导师想的只是帮我赚钱、打杂，其它方面一慨不闻不问，自己定课题，自己做实验，自己发文章，自己答辩，连毕业论文都没全篇看，只是要求在参考文献中把他的文章放在前面。虽然顺利通过答辩，但是实习两年期间真是苦闷！选择导师对自己科研道路影响很大，弄虚作假的导师作风会让子弟们蒙羞（嘿嘿，我就是这么想的，虽然导师名气很大，但是我知道业内人是怎样评价的，所以现在很少提及导师姓名）。
我硕士已经毕业一年了，想想硕士期间真是空虚！导师想的只是帮赚钱、打杂，其它方面一慨不闻不问，自己定课题，自己做实验，自己发文章，自己答辩，连毕业论文都没全篇看，只是要求在参考文献中把他的文章放在前面。虽然顺利通过答辩，但是实习两年期间真是苦闷！选择导师对自己科研道路影响很大，弄虚作假的导师作风会让子弟们蒙羞（嘿嘿，我就是这么想的，虽然导师名气很大，但是我知道业内人是怎样评价的，所以现在很少提及导师姓名）。
我硕士已经毕业一年了，想想硕士期间真是空虚！导师想的只是帮赚钱、打杂，其它方面一慨不闻不问，自己定课题，自己做实验，自己发文章，自己答辩，连毕业论文都没全篇看，只是要求在参考文献中把他的文章放在前面。虽然顺利通过答辩，但是实习两年期间真是苦闷！选择导师对自己科研道路影响很大，弄虚作假的导师作风会让子弟们蒙羞（嘿嘿，我就是这么想的，虽然导师名气很大，但是我知道业内人是怎样评价的，所以现在很少提及导师姓名）。
在微生物方面的工作，可能我的资历很浅，只做了半年，所发表的言论难免有贻笑大方的危险，但也有旁观者清的可能，因此，仍要把我的一点小小的感悟拿出来与大家分享一下：
一要选好方向，可以从网站上了解一下哪些是夕阳课题，哪些是热门方向，然后尽量选择有影响力的方向，不要不撞南墙不回头。时间是有限的，我们尽量要使我们的工作更有效率。
二要查阅资料，当然要尽量查一些比较权威的资料，如SCI,EI等等，而且一定要查的全，总结好前人的工作和经验。
三要做好实验设计，可以应用统计学的知识，比如正交实验法，就可以让我门少做一些没有必要的工作。
第四点我觉得无论是微生物还是什么别的科目，最重要的就是要养成良好的科研习惯，认真对待每一次实验，认真分析，不要怕辛苦，不要偷懒。机会总是青睐有准备的人。我们应该端正实验态度，培养严谨的科研习惯，有细心，有耐心，放弃天上掉馅饼的幻想，踏踏实实做好实验，多和实验室的师兄师姐沟通，因为他们有很多宝贵经验，可以避免走弯路，而且大家都是同龄人，也容易沟通，我们只要不耻下问就可以了。
就想到这些，难免有浅薄之处，请大家见谅了！
给新生们指名方向哈哈，给个鼓励！
我也来凑一份子。
题目：不要盲从所谓的大牛。
故事：几年前我在从事益生菌研发，主要负责实验室工作。我们分离得到了几株乳酸菌，其生长特性及对致病菌的抑制效果等各方面的特性均表现不错，我们选了一株进行发酵条件的优化，并进行了小试研究，研制了一种益生素配方，并在养殖场进行了饲喂效果试验，反映较好。所以，老板将该菌及相关配方拿到某家国内知名的发酵企业做中试和生产。由老板和某发酵专家制定发酵方案，呵呵，怪事出现了，该菌在中试罐里就不生长了，没有生长的迹象，反反复复都是如此。后来，老板没有办法，就叫我过去看看，我到厂里，他们正在进行新的一批发酵，已经接种8小时了，OD一点变化的没有，他们正在商量是否倒罐。我说你们先别着急，等我看一下再说吧，我花了半小时，看了他们的配方和工艺以及管道走向等，说了一句，“把进气口关上”，负责人说，“不行啊，会污染的。”我很有信心的说，“不会的，放心吧，这株菌不会被污染。“结果关上进气口，2小时后，OD明显升高，通过pH测定和镜检观察，确定没有被污染，从此中试和发酵生产顺利进行。原来，该企业一直做的都是好氧菌，通行做法是5吨罐需要保持5公斤的罐压，防止污染。大家知道，乳酸菌是兼性厌氧的，通气保压自然会导致乳酸菌生长受到抑制。
结论：1.思维会有定势，专家也会犯错。
2.我们常常说在学校没有学到东西，或者学的东西没有用；其实是我们没有学到家，没有学活，不会应用。
我也show一个
在我最开始提金黄色葡萄球菌DNA的时候，很久都提不出来，参考文献大都是用溶金葡菌酶，那可要500快提一株，我的实验光是买酶也要10000多。也到求助过，很多人支招，什么加青霉素，再用超声，还有直接超升，效果都不理想。一次加了溶菌酶，心情不好，没有做，第二天准备换掉，拿出来的时候发现已经成了绪状，大喜，难道这就是传说中的破壁，拿来提DNA，成功，效果非常好。溶菌酶才几十快钱，而且一支就足够了。但是要记得多加些，大概50-100mg
希望能给做格兰氏阳性菌的兄弟们提供帮助。
题目:预实验很重要
实验中预实验非常重要.我做课题时已经是老板的关门弟子,老板在我之前也3年没招学生,实验室久已尘封,所以一切都是自己洗刷.当时没有做过细胞培养,老板说自己的CO2培养箱很好用,当时信以为真.其他实验耗材、仪器设备(都不是老板自己实验室的)都进行了预试,就CO2培养箱通了一天电,开了一下气筏,就急急进行正式实验.实验时第二天CO2培养箱温度上到了50多度,细胞全死了,恨得我差点吐血,我的一百余只小鼠的动物模型,就这样玩完了.
所以,没有连续用的仪器设备一定要预试,否则结果难以预料啊.
题目：摆正心态
1，做实验就是尝试，就像尝试一段恋情，尝试投个三分球，更像是踢足球，可能组织了半天进攻，结果球却没进。不能被这些失败的尝试打倒。
2，不要太急，要一步一个脚印。省偷1分钟的懒可能需要n倍的时间去弥补。
3，想和做，所谓的理论联系实际，这些以前可能觉得挺虚，现在觉得挺实。
我博士专业是计算机软件与理论，现在做计算生物学的博士后，主要是做微生物中的转座子的研究。转座子（transposon）在微生物中主要是DNA transposons，决多部分都是Insertion Sequences。
我的体会，第一条就是必须要与生物结合起来做，或者与做生物试验的人合作研究，或者是自己下功夫多看文章。计算生物学中，只有做有实际生物意义的内容，才可能长久发展，否则永远都得跟着别人来做。
第二条，动作要快，特别是做比较热门的东西。计算生物学的一个特点就是，快！作出工作的速度快，发表方面也快（与计算理论相比），自己的课题被别人赶超地也快！
第三条，要多参加会议、seminar等，多与别人讨论。与别人的brain-storming式的讨论，对研究非常有益。这里我要感谢我的合作者：lylover。
希望以上内容对大家有用，也欢迎大家到生物信息学版面逛逛，找到合适的计算生物学合作者！
从事微生物工作四年有余，从细菌到酵母再到病毒是我工作过程的主线，在其中酸甜苦辣都有，个人主要心得有以下几点：
1 选材，现今信息交流相当迅速与方便，实验方法不是科研的主要障碍，独特的实验材料是成功的一半，很多时候能问别人要到实验的具体方法，但很难要到一些宝贵的实验材料。
2 清晰的科研思路，好的思路来源于实践经验的积累，对前沿进展的了解及广泛知识与信息交流的总结
3 选定一个自己感兴趣的研究方向，长期做下去，总会出成绩（有成就的人大多如此）
支持斑竹的工作，也说一点感想！
我从事微生物发酵工作5年，后又进行分子生物学实验将近三年，在此期间我做过
几个大的项目，也亲自下过车间，建设过车间、实验室、中试等等，可以说感想很多，
也想唠叨几句，各位见笑了！
1、首先我们应该不要去管别人怎么样，关键的还是首先要管好自己。就象以上战友讨论的一样
有一个良好的习惯和作风，老板导师不好，就是自己努力也照样能成才，虽然有时是苦了些，但是
我们靠自己走出来的路都会留下我们自己的足迹，也就是我们能够学习到很多的经验教训，其实
大家也很明白，靠一两年的时间做出很大的成绩是很难的，所以我们关键是要学习技术，提高自己
各方面的技能。
2、抓住任何机会，发牢骚是没有用的，不如用这点时间去学习。这样说简单，能做到的人可是很少，
但是能做到这点的肯定是不一般的人。
3、作实验首先要有良好的习惯，我们每个步骤都要仔细认真，我曾经由于不仔细配错了一点药品，导致
我三个月没有做出一点东西。做的慢没有关系，关键我们要一步一个脚印的做，这样反而会更加节省时间。
部分战友已经感知到了！
4、认真观察，认真分析，经常要和相关人士进行探讨学习！我们进行实验时就是和国外教授经常联系，
他们都很认真的回答我们提出的问题，我们每次也都很认真的告诉他们我们实验的进展情况。提供各经验
和老外打交道需要认真负责，每次发邮件时要把细节写的清楚，同时很真诚的道谢，一般都会有所收获的。
5、在什么地方就要适应什么样的环境，既然我们不能改变它那我们就去适应它，在适应的同时我们也会
有很大的收获。我经历了五六岗位，换了几次工作，每次开始都会不适应，但是自己踏心下来把工作和实验
搞的很好，然后我就又有了更多的机会。
6、兴趣是做好一件事情很关键的要素，所以我们尽量去选择自己感兴趣的东西，如果有选择机会的话。
坚持说来简单，真正能坚持到底的绝对是英雄。应为我有很多次都没有坚持下来，有毅力和横心坚持完成
一件任务的人绝对值得佩服。
7、时间不等人，要抓紧机会，一步错拉下，那么可能会一辈子被拉下！
