Re:【讨论】内皮祖细胞专业讨论区
yanglong1001 wrote:
这是指单个核细胞的数,EPC只占很少部分.我分离的单核细胞量多在2-3*10的6次方/ml
人外周血中白细胞数<10*10的9次方/l,单核细胞<1*10的9次方/l,据文献报道,EPC 仅占单核细胞的0.0001%-0.01%,,推算下来即<1*10的5次方/l,约<100个/ml,请问战友计算出的单核细胞数是用什么方法数的,是染核用荧光显微镜数吗?新手上路,多谢关照!
请教各位战友,我想测外周血浆NO水平,用肝素抗凝血,离心后取上清备用,需要在多少度保存,能保存多长时间啊?
dearnesta wrote:
yanglong1001 wrote:
这是指单个核细胞的数,EPC只占很少部分.我分离的单核细胞量多在2-3*10的6次方/ml
人外周血中白细胞数<10*10的9次方/l,单核细胞<1*10的9次方/l,据文献报道,EPC 仅占单核细胞的0.0001%-0.01%,,推算下来即<1*10的5次方/l,约<100个/ml,请问战友计算出的单核细胞数是用什么方法数的,是染核用荧光显微镜数吗?新手上路,多谢关照!
正如占有所列出的数据显示，人外周血分离出2-3*10的6次方/ml的单核细胞不太合理。密度梯度离心所分离的细胞除单核细胞外，由许多淋巴细胞，尤其是用密度1.075或1.077的分离液淋巴细胞更多，用两步法分离力的单核细胞比较纯（也是文献所说，我没做过）。我用的是淋巴细胞分离液，密度1.077，计数是直接用细胞计数板显微镜下数，不可避免大量的非单核细胞计入其中。本版内有许多战友提供分离的单核细胞的经验可借鉴。
dearnesta wrote:
yanglong1001 wrote:
这是指单个核细胞的数,EPC只占很少部分.我分离的单核细胞量多在2-3*10的6次方/ml
人外周血中白细胞数<10*10的9次方/l,单核细胞<1*10的9次方/l,据文献报道,EPC 仅占单核细胞的0.0001%-0.01%,,推算下来即<1*10的5次方/l,约<100个/ml,请问战友计算出的单核细胞数是用什么方法数的,是染核用荧光显微镜数吗?新手上路,多谢关照!
你好，文献报道，现在体外epc计数不能反应循环epc的绝对数量，但如果想准确一点分离到单个核细胞的话，建议你用percoll非连续剃度离心，取30％－50％之间的细胞，因为单核细胞的漂浮密度为1.050－1.066，50％percoll的漂浮密度为:1.067,淋巴细胞为：1.052－1.077，而ficoll的比重为1.077，如果用ficoll就混有大量的淋巴细胞。因此，如果想较纯的分离epc，建议你用percoll。
请教版主和各位高手一个问题：
血管内皮祖细胞在理论上能否具备分化为其他胚层细胞的能力？比如说角膜内皮细胞，该细胞可能来源于中胚层或神经表皮层组织。
从概念上讲好象不通，因为只有一种细胞最终分化成了血管内皮细胞，它才被称为血管内皮祖细胞，是这样吗？
如果这样，外周血中是否存在其他来自骨髓的干细胞？是否可以用来向角膜内皮细胞分化？
请大家帮忙解答，不胜感谢！
看来楼主是眼科的吧，我前端时间刚刚查了一些角膜内皮细胞的文献，在此与大家一起讨论。
关于角膜内皮细胞能否替代角膜内皮的问题，只有一家单位研究过（在综述上看到的），好像可行，不过没有后续研究。
两者的起源似乎有些不同，角膜内皮起源于颅神经嵴细胞（外胚层），虽然中间变成间充质样的形态，迁移到一定位置后才分化成角膜内皮细胞。
内皮祖细胞来源于胚外中胚层的一些间充质细胞，当然在成体骨髓中也有存在，但讲其胚胎来源还是有所差异。
现在没人可以判断一种类型的祖细胞没有分化成为其他细胞类型的能力，可能只是目前的能力有限或者手段受限制而已。
自己的一点理解。
感谢qjzhou2000 班主的指点，看来是同道啦，幸会幸会，
您的观点对我帮助很大。
好像在老的教科书上说角膜内皮细胞来自于中胚层，但是这与其极其低下的分裂能力不符，于是现在的观点说它来自于神经表皮层，应该说是没有定论的观点。再就是我感觉现在所谓的干细胞、祖细胞只是人为的划分而已，有太多的未知因素在里边，我们只能边看边学，有可能过一段时间这些概念会有全新的更改也说不定啊。
我想做这方面的尝试，只是担心实力和能力不足
另外也在尝试MSC 的分化途径，希望多多交流，下面是我的另一个帖子，恳请赐教
>
大有帮助
再请教版主和guigli 一个问题。
原来版主对眼科的内容也有兴趣啊，我也是眼科的，现在研究内皮祖细胞与DR的关系，很多文献都提到糖尿病患者体外移植EPC或许加重DR的发生，但有文献报道从现在做过的900例体外移植的动物模型和人中，没有发现一例有DR的发生或加重。我认为DR的病理基础是视网膜毛细血管闭塞引起的，EPC或许对此有一定的治疗作用而不是加重其的发展。不知道版主和各位战友有什么看法。
谢谢！
fanglijian519 战友您好！
老实说我对你提到的问题所知甚少，因为我关注EPC的研究也就半年多的时间，有些文献还没有理解，对DR更是没有看到。想问您一下：糖尿病患者体外移植EPC是什么意思？是临床研究吗，也就是为糖尿病患者进行EPC移植？EPC来自自体还是他人？
我曾经看到过脉络膜新生血管来自于骨髓起源的干细胞的文章，还有一篇好象说骨髓来源细胞参与了视网膜血管的胚胎分化。因此EPC有可能到达视网膜毛细血管，参与病变修复。
scularization Is Provided by Bone Marrow Cells.htm (104.43k)
To guigli :
我做的是临床研究，现在已完成了基本的EPC培养和鉴定，下一步就打算正式开始临床调查了，众所周知，糖尿病患者外周血管疾病(PVD)是糖尿病患者死亡的重要因素，现在很多报道说EPC对血管内皮的修复作用对糖尿病患者PVD有很好的治疗作用，但目前还没有人做过对DR的研究，因此，小弟想在这方面做做，希望大家多多指教！
谢谢！
大家好，我是新手。最近在养大鼠 诱导EPC向外周血动员。但是发现根本买不到大鼠的流式抗体。可以买到的只有CD31和CD144.怎么办啊？为什么大鼠的抗体这样难买呢？
急切的得到各位高手的指点！谢谢！
同时，还有人是做糖尿病大鼠的么？真的是很痛苦啊，死亡率太高了。我觉得要作不下去了。
有没有人和我交流一下呢？
请教版主和各位高手一个问题：
我最近鉴定内皮祖细胞发现：用流式在第七天鉴定是CD34、CD133和KDR的阳性率不是很高，特别是CD133，都不到5%,（我做流式用的全是BD公司和R&D公司荧光直标抗体，但用的阴性对照，没有用同型对照），而同批细胞做的acLDL吞噬和UEA绑定实验（免疫荧光，共聚焦显微镜下观察），结果双染的阳性率达到90％以上，文献报道：荧光双染的为正在分化中的内皮祖细胞，也就是说我得到的正在分化中的内皮祖细胞已经达到90以上，但是CD133或CD34（阳性率《30％）却如此低，这种情况怎么解释？实在令人费解，希望版主和各位高手不惜赐教！
to 雨中人：
我养的是脐静脉内皮祖细胞，
我也见过这种情况，你可以做个流式看看是否已经分化成内皮细胞了，
我用的是F12加20％gibico胎牛血清，bFGF,VEGF,牛脑垂体提取物。
我用DiI-ac－LDL 标记过，效果很好啊！
一下是我做的DiI-ac－LDL 染色，和第14天的epc（可能已经分化了）
还想问问各位高手怎么才能抑止epc的分化。
screen.width-333)this.width=screen.width-333" width=489 height=393 title="Click to view full clip_image002.jpg (489 X 393)" border=0 align=absmiddle>
尊敬的版主和各位高手：
本人在养内皮祖细胞(EPC)时碰到了一个很棘手的问题，就是在不到两周的时间内EPC就大部分分化为了内皮细胞，请问用什么方法可以使细胞分化的慢一点？我用的培养液是F12/DMEM(含20％GIBICO胎牛血清、bFGF4ng/ml 、VEGF10ng/ml、牛脑垂体提取物4ug/ml）。
谢谢！
谢谢，各位的答复！
fanglijian519 wrote:
尊敬的版主和各位高手：
本人在养内皮祖细胞(EPC)时碰到了一个很棘手的问题，就是在不到两周的时间内EPC就大部分分化为了内皮细胞，请问用什么方法可以使细胞分化的慢一点？我用的培养液是F12/DMEM(含20％GIBICO胎牛血清、bFGF4ng/ml 、VEGF10ng/ml、牛脑垂体提取物4ug/ml）。
谢谢！
事实上，很多细胞都可以吞噬ac-LDL的。另外，我也怀疑过，能吞噬ac-LDL和Uea-1的细胞未必都是内皮类细胞。贴壁选择法培养EPC，早期的细胞显然不可能全部都是EPC，而是经过逐步的选择，其余细胞慢慢淘汰，余下EPC类细胞，而这时的EPC估计都已经是偏晚期的了。
你应该检测一下vWF，因为有一些的MSC在分化的过程中也表达CD31的，来鉴定你培养的是否是内皮类细胞。
脐血中还有一些外周内皮细胞(可能来源于脐静脉内皮细胞，而并非祖细胞)，在培养的过程中也可能会增殖起来，你应该尽量做几个祖细胞标志的CD分子，比如CD133、CD105，还有就是CD14以及CD45等，你是否做过？
另外，你把你后面继续培养的认为分化成内皮细胞的图片上传看看。
请问fanglijian519一下：
关于 DiI-ac－LDL 染色 问题
我选用的方法是选用骨髓诱导的第10天原代EPC，更换培养液时， 10ng/ml 抚育4H,12H 然后PBS洗涤3次
做了3次都没显色
我的步骤有问题吗？
谢谢指导
雨中人 wrote:
我选用的方法是选用骨髓诱导的第10天原代EPC，更换培养液时， 10ng/ml 抚育4H,12H 然后PBS洗涤3次
做了3次都没显色
我的步骤有问题吗？
谢谢指导
我曾经2.5ug/ml孵24小时效果不佳，在培养箱里没管，4天后一看着色很好。所以建议效果不好使适当延长时间。后来用10ug/ml过夜效果很好。此外我发现用爬片细胞做效果很差（本人愚笨），不如自接在培养孔里着色效果好-------有可以在激光共聚焦显微镜下拍照的培养板。
本版如此情景凄凉，望达者多给宝贵经验。鄙人姑发照片几张，聊供初入者借鉴。一为 DAPI染核
screen.width-333)this.width=screen.width-333" width=640 height=478 title="Click to view full -3.JPG (1392 X 1040)" border=0 align=absmiddle>
次为 Dil-acLDL
（缩略图，点击图片链接看原图）
末为FITC-UEA-1. 未作共聚焦，甚憾。
（缩略图，点击图片链接看原图）
to yanglong1001
应该用倍数高一些(至少物镜20倍，或者40倍)的观察，否则无法分清细胞核和细胞胞浆，理论上Dil-acLDL 和Uea-a均只在细胞浆中，不会出现在细胞核中，你的图片不能说明这些问题，感觉你的三种染料都表现在细胞核中，你可以把细胞的 几张不同染料叠加一下获得叠加图片就知道了。
用流式细胞仪来测外周血EPC的水平(浓度)，不知道怎么做啊？我也想搞这方面的课题。各位大虾指导一下。谢谢！
fanglijian519 wrote:
请教版主和各位高手一个问题：
我最近鉴定内皮祖细胞发现：用流式在第七天鉴定是CD34、CD133和KDR的阳性率不是很高，特别是CD133，都不到5%,（我做流式用的全是BD公司和R&D公司荧光直标抗体，但用的阴性对照，没有用同型对照），而同批细胞做的acLDL吞噬和UEA绑定实验（免疫荧光，共聚焦显微镜下观察），结果双染的阳性率达到90％以上，文献报道：荧光双染的为正在分化中的内皮祖细胞，也就是说我得到的正在分化中的内皮祖细胞已经达到90以上，但是CD133或CD34（阳性率《30％）却如此低，这种情况怎么解释？实在令人费解，希望版主和各位高手不惜赐教！
请问这位战友 你做的是大鼠的EPC吗？希望交流，QQ326039164
请教战友：
卧铺打算从脐带血养EPC
还要养平滑肌细胞
请问用什么培养基比较好
主要目的：EPC对于平滑肌组织的血管新生，探讨其对于植入体内后的再血管化
诚心请教用什么培养体系比较好
最好用共聚焦拍一下照，要不花大价钱而没有很好的图片，你的细胞就白做了。
大家好!不知各位老师还有需要内皮祖细胞的试剂吗?我是武汉同济的,最近刚买了一只CM-DiI(1mg/ml),后来查文献才发现买多了,想找人分一点,另有其他一些抗体等,如有需要可联系我
各位前辈：
我刚开始培养外周血的内皮细胞，想请教几个问题。
内皮培养都用FN铺板是为何，用其他的例如胶原不行吗？
我想定试剂查了以下的内容各位帮我看看对不对：
试剂 厂家 货号 价钱
1.UEA-1 sigma L9006 1404
2.DiI-acLDL invitrogen L3484
3.还有CD34，CD133，CD31这些流式抗体怎莫查不到呢？那个公司有货号多少我看有人用BD公司的为什么茶不到呢？大家 能把这些试剂 总结一下就方便多了
流式抗体就是普通的荧光抗体吗？
各位前辈：
内皮祖细胞鉴定的抗体那些来源的好买？那些不好买
比方说，大鼠 ，兔，狗，人
我的试验可能需要大动物 考虑用兔，狗，但是不知道好买试剂否
刚刚求得一篇很不错的最新综述，是97年的开山之作的作者之一参与写的，参考文献引用了两百多篇，看起来质量很高，这里贴出来大家共享：
one marrow-derived endothelial cell precursors.pdf (276.35k)
我一个多月没来了,今天一上来就得到所罗门战友的极佳提供,非常感谢!最接近接触了少许胚胎干细胞的信息,早回过头来思考我们的EPC,我觉得EPC应该实际一点,把研究力度集中在其恢复内皮功能,促进微细血管新生之方向上.广泛撒网不切实际,比如有人说EPC分化为许多不同的细胞,故不论这可不可信,就其效率而言,EPC分化为成熟细胞(多向分化)的潜力远不入胚胎干细胞.
得闲发点浅见,欢迎批评指正,吾闻过而喜.
