做pET15b转化BL21,pET手册上介绍这样的搭配是最适合pET15b表达的.可小试都丢得厉害,上罐更是一塌糊涂,蛋白得率让人都想摔柱子.种子中保存率90%,诱导后3h丢光.Amp浓度已经提高到150微克/ml,而且这么高浓度已经表现出对菌体积累有影响,还是没有改观.
诸位同行,在培养方式上,如温度\培养基成分\补料方式等,有没有能帮助质粒稳定遗传的经验,或者看到过可以借鉴的资料.
另外上游技术有没有关于这个的?看到有帖说用BL21gold或BL21codenplus有所改观,请问哪位有这方面资料.谢谢!~
呵呵，不必去怀疑pet的载体和BL21宿主菌，这些都是商业化的东西，都非常成熟了，应从你的表达基因开始，一点点的排查！
首先，应该确认你表达的基因是否过长，是否超过正常的表达范围！
在转化时，可以适当的提高LA平板上AMP的浓度，300微克每毫升到500 微克每毫升都应该可以的，这样的平板上长出的菌的数量明显比正常的50-100微克的平板上的菌数量少，也许这就是所谓的高拷贝质粒吧，我们以前做过这样的对照，高浓度AMP平板上长出的菌，明显比正常浓度AMP上长出的菌表达量高。
在保存菌种时，一定注意保存的菌种应该在对数生长末期，这时菌种的状态最高，而且质粒也应该最稳定，质粒丢失的比例最少，千万不要保存生长末期的菌种，那样菌种中就有很多丢失质粒了，如果再做为种子来发酵，影响会很大！ 另外，甘油浓度不要太高，一般10%-15%就可以了，虽然novegen公司自己说为了保证质粒稳定性，甘油密度不能超过10%，如果按照他们说的，菌种保存 几个月 就全死光了，没啥价值！20% 可能有点高，10%-15% 就应该可以了。
如果上面的都严格控制好了，做小样表达时，质粒应该不会丢失的太厉害了，在做发酵活化种子时应注意，尽量挑取菌苔（最近中检所也肯定了这个做法）而不挑取单克隆，这样可以避免挑取菌种的随机性，保证正常的表达量。活化的种子一般都是过夜培养，这时温度不要太高，转速不能太快，控制其生长速率，避免种子长得太老！另外，上罐时不要为了缩短生长时间而把接种比例做的太高，不要超过1：20，如果太高，会把种子液中大量的贝塔内酰胺酶带入上罐培养基，使罐内的ＡＭＰ被迅速分解，减小了选择压力，质粒丢失的情况肯定会更加严重。
另外可以用羧苄青霉素代替胺苄青霉素，部分原因是羧苄青霉素在低ｐＨ时具有更高的稳定性，可以防止被酶解，保持选择压力，防止质粒丢失。
恩~ 先记下! 谢谢! 我下来再看看~有问题再来请教!
表达的基因过长（蛋白分子量65kd左右）又会有怎样的后果呢，提前终止转录或翻译，还是根本就不表达呢？
有没有相应的调控表达方法呢？
