【摘要】目的研究流行性出血热（EHF）肾组织中增殖细胞核抗原（PCNA）和波形丝蛋白（vimentin）的表达及意义。方法应用多重PAP免疫组化方法，对17例EHF尸检肾组织中PCNA和vimentin的表达进行观察。结果EHF尸检肾组织PCNA的阳性率为64.71％，集合管的增殖指数显著大于远曲小管（P∨0.01），低血压休克期患者远曲小管和集合管上皮细胞vimentin呈强阳性表达，相同部位PCNA也呈阳性，PCNA的阳性强度与局部病变的程度相一致。结论EHF患者急性肾功能衰竭的早就存在损伤肾小管上皮细胞的再生、增殖和分化，这些变化在EHF肾损伤的修复反应中具有重要的意义。

　　流行性出血热（EHF）累及肾脏时，可表现为不同程度的急性肾功能衰竭（ARF）。组织形态学及免疫组化研究表明，EHF肾损伤除肾髓质出血外，主要表现为肾小管不同程度的变性、坏死和细胞骨架改变〔1，2〕。目前认为，病毒的直接作用、免疫因素和炎性介质的参与，以及低血压休克共同作用所致肾小管上皮细胞损伤是ARF的主要原因，但对肾脏损伤后的修复过程却了解甚少。我们以抗增殖细胞核抗原（PCNA）和抗波形丝蛋白（vimentin）的单克隆抗体（mAb），检查了受损伤的肾组织中肾小管上皮细胞的增殖和分化，并探讨了肾小管上皮细胞的再生在肾损伤后修复过程中的作用。

　　1.材料和方法

　　1.1　材料肾组织标本取自17例EHF患者尸检肾脏（由上海医科大学病理学教研室提供），其中男14例，女3例，年龄20～58岁。临床分期：低血压休克期5例、少尿期11例、恢复期1例。所有病例既往均无急、慢性肾脏病病史，但均有不同程度的ARF，死后经组织病理学和检测病毒抗原而确诊。正常对照组（5例）的标本取自肾良性肿瘤旁的组织，经HE染色后光镜观察，肾组织的形态结构基本正常。上述组织经100mL/L福尔马林固定、石蜡包埋，制成连续性切片（5μm）后待检。免疫组化中所用一抗为抗PCNA（PC10，1∶100，DaKo公司产品）的mAb和抗波形丝蛋白（vimintinV9，1∶200，DaKo公司产品）的mAb。

　　1.2　方法

　　1.2.1　EHF肾组织的免疫组化染色采用多重PAP染色法〔3〕。主要步骤：组织切片脱蜡至水，以甲醇（800mL/L）H2O2（3.3mL/L）处理40min，灭活内源性过氧化物酶后，再以20mL/L正常羊血清37℃封闭1h.然后依次加抗PCNAmAb（1∶100）或抗vimentinmAb（1∶200，4℃孵育72h），羊抗鼠IgG（1∶300，本室制备）及鼠PAP（1∶10000，武汉生物制品所）进行多重PAP染色。实验中以正常肾组织替代EHF患者的肾组织，以无关mAb或替代一抗及同一组织片作为自身对照。医学教育网搜集整理

　　1.2.2　PCNA＋细胞核的定量采用了以下几个指标：①每个肾小球中PCNA的相对均值为所有肾小球中PCNA＋细胞总数除以肾小球个数。②分别计数肾小管不同部位PCNA＋的细胞，并随机计数10个高倍视野中PCNA＋的肾小管上皮细胞数。③增殖指数（PI）为平均每个高倍视野中PCNA＋的细胞数。所获结果以━±s表示，组间均数的差异采用t检验。

　　2.结果

　　2.1　EHF肾组织中PCNA的表达17例EHF患者的肾脏中，有11例PCNA呈阳性（64.71％）。各节段肾小管的PI值不尽相同（3.13～22.99）。PCNA＋细胞主要分布于远曲小管和集合管，但集合管的PI值显著大于远曲小管（P∨0.01）。肾皮质远曲小管也有不同程度的PCNA表达，定位于细胞核。肾小球中PCNA的相对平均值为1.63，与正常对照组无显著差异（P∧0.05）。PCNA＋细胞不仅见于形态正常的肾小管，也见于“增生的集合管”（7/11例）。其中6例在PCNA表达的部位伴有不同程度的肾小管损伤、出血等病变。另外，部分病例的血管内皮细胞（2/17）和间质中，浸润的炎细胞PCNA的表达呈阳性。在低血压休克期患者的肾脏中，可检出PCNA的表达（4/5例），少尿期PCNA＋细胞数增多，但无统计学意义（P∧0.05）。10例正常对照组的肾组织仅1例PCNA呈阳性，且PCNA＋细胞数极少。

　　2.2　EHF肾组织中vimentin的表达17例EHF患者的尸检肾脏中，肾小球vimentin的表达同正常对照组；9例低血压休克期患者肾脏的远曲小管及集合管上皮细胞vimentin的表达呈阳性，定位于胞浆近基膜处，外髓部位的集合管表达极弱。有6例患者的组织连续切片中，PCNA和vimentin表达于同一部位的集合管，且大多数集合管上皮细胞有变性坏死。表达vimentin的小血管有不同程度的扩张和充血，尤以髓质为甚并伴有出血。正常对照组的肾小球、大血管内皮和平滑肌中vimentin呈均匀分布，但肾小管呈阴性。

　　2.3　病理形态学改变8例EHF患者的肾小球毛细血管扩张充血，并伴有系膜区增宽或轻度系膜细胞增生，3例有局灶、节段性肾小球纤维化。近曲小管上皮细胞有玻璃样变性者3例、坏死者9例；髓质肾小管上皮细胞发生变性坏死者13例、腔内有蛋白管型者8例、上皮细胞管型者9例、红细胞管型者9例和盐类结晶者6例。5例肾髓质部位有灶性坏死，10例有肾小管再生的形态学表现，以集合管最明显，偶见核分裂相。14例肾间质有不同程度的水肿和血管扩张、淤血，16例伴有弥漫性出血，9例有散在淋巴细胞和单核细胞浸润。

　　3.讨论

　　PCNA是细胞DNA聚合酶的辅助蛋白，具有促进DNA聚合酶δ延伸DNA链，及增强DNA聚合酶Ⅲ活性的作用。近年研究发现，在损伤细胞的DNA修复过程中，也表达PCNA〔4〕。Vimentin是一类中间丝蛋白，正常仅表达于间质细胞，是细胞早期增殖、分化的标志之一。缺血后2～5d，vimenti3片段的表达增强，提示损伤部位有细胞的增殖反应〔5〕。

　　本研究结果显示，在EHF低血压休克期病例的远曲小管和集合管上皮细胞vimentin呈强阳性表达，PCNA呈阳性，且后者表达的强度与局部病变的程度相一致，提示这些部位的上皮细胞存在DNA的损伤和修复。Vimentin＋的上皮细胞是确定肾脏修复的重要标志。此外，PCNA的表达不仅出现于再生的小管细胞，在病变区内形态正常的肾小管上皮细胞也呈阳性，而在近曲小管和肾小球中则较少出现阳性。

　　综合以上表明，EHF患者的肾组织中存在着肾小管上皮细胞增生、分化的重要证据。肾小管上皮细胞vimentin和PCNA的表达，提示本病的早期就存在损伤肾小管的增生反应；肾脏远曲小管既是损伤严重的部位，也是再生修复最活跃的部位，在EHF患者肾损伤的修复中具有重要的意义。

　　参考文献：

　　〔1〕Cosgriff TM， Richard M. Mechanisms of disease in hemorrhagic fever with renal syndrome〔J〕。Kidney Int， 1991；40（Su l.35）：S72 － S79。

　　〔2〕陈威，杨守京，刘彦仿，等。免疫组织化学研究流行性出血热肾组织中细胞骨架蛋白和IV型胶原的改变〔J〕。第四军医大学学报，1997；18（3）：201－206。

　　〔3〕杨守京，刘彦仿，刘莹莹，等。多重PAP及多重PAP结合ABC免疫细胞化学方法的建立、敏感性分析与应用〔J〕。中国组织化学与细胞化学杂志，1993；2（1）：42－52。

　　〔4〕Shivji MKK， Podust VN， Hu cher U， et al. Nucleotide excision repair DNA synthesis by DNA polymerase e ilon in the presence of PCNA，RFC and RPA〔J〕。Biochemistry， 1995；34（15）：5011－ 5017。

　　〔5〕Witzgall R， Brown B， Schwarz C，et al. Localization of proliferating cell nuclear antigen，vimentin， c Fos， and clusterin in the postischemic kidney. Evidence for a heterogeneous genetic re o e among nephron segments and a large pool of mitotically active and dedifferentiated cells〔J〕。J Clin Invest， 1994；93：2175 － 2188。